Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima tulemuse saavutamiseks soovitame kasutada uuemat brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiimi). Seni kuvame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Modilise muutuse (MC) loommudelite loomine on MC uurimise oluline alus. Viiskümmend neli Uus-Meremaa valget küülikut jagati platseebo-operatsiooni gruppi, lihase implantatsiooni gruppi (ME grupp) ja nucleus pulposus implantatsiooni gruppi (NPE grupp). NPE grupis paljastati lülivaheketas anterolateraalse nimmepiirkonna kirurgilise lähenemise abil ja nõela abil punkteeriti L5 selgroolüli keha otsaplaadi lähedalt. NP eemaldati L1/2 lülivahekettast süstla abil ja süstiti sinna. Puuriti auk subhondraalsesse luusse. Lihase implantatsiooni grupis ja platseebo-operatsiooni grupis olid kirurgilised protseduurid ja puurimismeetodid samad, mis NP implantatsiooni grupis. ME grupis pandi auku lihasetükk, platseebo-operatsiooni grupis aga auku midagi ei pandud. Pärast operatsiooni tehti MRI-skaneerimine ja molekulaarbioloogiline testimine. NPE grupis signaal muutus, kuid platseebo-operatsiooni grupis ja ME grupis ilmseid signaalimuutusi ei täheldatud. Histoloogiline vaatlus näitas, et implanteerimiskohas täheldati ebanormaalset koeproliferatsiooni ning IL-4, IL-17 ja IFN-γ ekspressioon oli NPE rühmas suurenenud. NP implanteerimine subhondraalsesse luusse võib moodustada MC loommudeli.
Modilised muutused (MC) on selgroolülide lõppplaatide ja külgneva luuüdi kahjustused, mis on nähtavad magnetresonantstomograafial (MRI). Need on üsna tavalised inimestel, kellel on seotud sümptomid1. Paljud uuringud on rõhutanud MC olulisust selle seose tõttu alaseljavaluga (LBP)2,3. de Roos jt4 ja Modic jt5 kirjeldasid esimestena iseseisvalt kolme erinevat tüüpi subhondraalse signaali anomaaliat selgroolüli luuüdis. Modilised I tüüpi muutused on hüpointensiivsed T1-kaalutud (T1W) järjestustes ja hüperintensiivsed T2-kaalutud (T2W) järjestustes. See kahjustus paljastab luuüdis fissuurilised lõppplaadid ja külgneva vaskulaarse granulatsioonikoe. Modilised II tüüpi muutused näitavad nii T1W kui ka T2W järjestustes kõrget signaali. Seda tüüpi kahjustuse korral võib leida lõppplaadi hävimist, samuti külgneva luuüdi histoloogilist rasvast asendamist. Modilised III tüüpi muutused näitavad T1W ja T2W järjestustes madalat signaali. On täheldatud lõppplaatidele vastavaid sklerootilisi kahjustusi6. MC-d peetakse selgroo patoloogiliseks haiguseks ja see on tihedalt seotud paljude selgroo degeneratiivsete haigustega7,8,9.
Olemasolevaid andmeid arvesse võttes on mitmed uuringud andnud detailse ülevaate MC etioloogiast ja patoloogilistest mehhanismidest. Albert jt. pakkusid välja, et MC võib olla põhjustatud ketasherniatsioonist8. Hu jt. omistasid MC raskele ketasdegeneratsioonile10. Kroc pakkus välja „sisemise kettarebendi“ kontseptsiooni, mille kohaselt korduv ketastrauma võib viia ketta lõppplaadi mikrorebenditeni. Pärast lõhe teket võib lõppplaadi hävimine nucleus pulposus'e (NP) poolt vallandada autoimmuunvastuse, mis omakorda viib MC11 tekkeni. Ma jt. jagasid sarnast seisukohta ja teatasid, et NP-indutseeritud autoimmuunsusel on MC12 patogeneesis võtmeroll.
Immuunsüsteemi rakud, eriti CD4+ T-abistajarakud, mängivad autoimmuunsuse patogeneesis olulist rolli13. Hiljuti avastatud Th17 alamhulk toodab põletikku soodustavat tsütokiini IL-17, soodustab kemokiinide ekspressiooni ja stimuleerib kahjustatud organite T-rakke IFN-γ tootmiseks14. Th2-rakkudel on immuunvastuste patogeneesis samuti ainulaadne roll. IL-4 ekspressioon tüüpilise Th2-rakuna võib viia tõsiste immunopatoloogiliste tagajärgedeni15.
Kuigi MC kohta on läbi viidud palju kliinilisi uuringuid16,17,18,19,20,21,22,23,24, puuduvad endiselt sobivad loomkatsete mudelid, mis suudaksid jäljendada inimestel sageli esinevat MC protsessi ja mida saaks kasutada etioloogia või uute ravimeetodite, näiteks sihipärase ravi uurimiseks. Praeguseks on teatatud vaid vähestest MC loommudelitest, mis uurivad selle aluseks olevaid patoloogilisi mehhanisme.
Alberti ja Ma pakutud autoimmuunteooria põhjal loodi selles uuringus lihtne ja reprodutseeritav küüliku MC mudel, mis seisneb NP autotransplanteerimises puuritud selgroolüli otsaplaadi lähedale. Teised eesmärgid on jälgida loommudelite histoloogilisi omadusi ja hinnata NP spetsiifilisi mehhanisme MC arengus. Sel eesmärgil kasutame MC progresseerumise uurimiseks selliseid tehnikaid nagu molekulaarbioloogia, MRI ja histoloogilised uuringud.
Kaks küülikut surid operatsiooni ajal verejooksu tõttu ja neli küülikut surid MRI ajal anesteesia ajal. Ülejäänud 48 küülikut jäid ellu ja neil ei ilmnenud pärast operatsiooni käitumuslikke ega neuroloogilisi tunnuseid.
MRI näitab, et erinevates aukudes oleva manustatud koe signaali intensiivsus on erinev. NPE rühmas muutus L5 lülikeha signaali intensiivsus järk-järgult 12, 16 ja 20 nädalat pärast sisestamist (T1W järjestus näitas nõrka signaali ja T2W järjestus näitas segasignaali pluss nõrka signaali) (joonis 1C), samas kui kahe teise manustatud osade rühma MRI-pildid jäid samal perioodil suhteliselt stabiilseks (joonis 1A, B).
(A) Küüliku nimmelülide representatiivsed järjestikused MRI-d kolmel ajahetkel. Kontrolloperatsiooni rühma piltidel signaalianomaaliaid ei leitud. (B) ME rühma lülikeha signaaliomadused on sarnased kontrolloperatsiooni rühma omadega ja aja jooksul ei täheldatud kinnituskohas olulisi signaalimuutusi. (C) NPE rühmas on madal signaal T1W järjestuses selgelt nähtav ning segasignaal ja madal signaal on T2W järjestuses selgelt nähtavad. 12-nädalasest perioodist 20-nädalase perioodini vähenevad T2W järjestuses madalaid signaale ümbritsevad juhuslikud kõrged signaalid.
NPE rühmas on selgroolüli implantatsioonikohas näha ilmset luu hüperplaasiat ning luu hüperplaasia tekib 12–20 nädala jooksul kiiremini (joonis 2C) võrreldes NPE rühmaga, modelleeritud selgroolülide osas olulisi muutusi ei täheldatud; Shami rühm ja ME rühm (joonis 2C) 2A,B).
(A) Lülisamba keha pind implanteeritud osas on väga sile, auk paraneb hästi ja lülikehas ei ole hüperplaasiat. (B) ME rühmas on implanteerimiskoha kuju sarnane platseebo-operatsiooni rühma omaga ja implanteerimiskoha välimuses ei ole aja jooksul ilmseid muutusi. (C) NPE rühmas esines implanteerimiskohas luu hüperplaasia. Luu hüperplaasia suurenes kiiresti ja levis isegi läbi lülidevahelise ketta vastasküljele.
Histoloogiline analüüs annab luu moodustumise kohta detailsemat teavet. Joonis 3 näitab H&E-ga värvitud postoperatiivsete lõikude fotosid. Võrdoperatsiooni rühmas olid kondrotsüüdid hästi paigutunud ja rakkude proliferatsiooni ei tuvastatud (joonis 3A). Olukord ME rühmas oli sarnane võltsoperatsiooni rühmaga (joonis 3B). NPE rühmas täheldati aga implanteerimiskohas suurt hulka kondrotsüüte ja NP-sarnaste rakkude proliferatsiooni (joonis 3C);
(A) Trabeekulumid on näha otsaplaadi lähedal, kondrotsüüdid on korralikult paigutunud, ühtlase suuruse ja kujuga ning proliferatsiooni ei esine (40 korda). (B) ME-rühma implantatsioonikoha seisund on sarnane kontrollrühma omaga. Trabeekulumid ja kondrotsüüdid on nähtavad, kuid implantatsioonikohas ilmset proliferatsiooni ei ole (40 korda). (B) On näha, et kondrotsüüdid ja NP-sarnased rakud prolifereeruvad märkimisväärselt ning kondrotsüütide kuju ja suurus on ebaühtlane (40 korda).
Interleukiin 4 (IL-4) mRNA, interleukiin 17 (IL-17) mRNA ja interferoon γ (IFN-γ) mRNA ekspressiooni täheldati nii NPE kui ka ME rühmas. Sihtgeenide ekspressioonitasemete võrdlemisel oli IL-4, IL-17 ja IFN-γ geenide ekspressioon NPE rühmas oluliselt suurenenud võrreldes ME rühma ja platseebo-operatsiooni rühmaga (joonis 4) (P < 0,05). Võrreldes platseebo-operatsiooni rühmaga suurenesid IL-4, IL-17 ja IFN-γ ekspressioonitasemed ME rühmas vaid veidi ega saavutanud statistilist muutust (P > 0,05).
IL-4, IL-17 ja IFN-γ mRNA ekspressioon NPE rühmas näitas oluliselt kõrgemat trendi kui platseeborühmas ja ME rühmas (P < 0,05).
Seevastu ME rühma ekspressioonitasemed ei näidanud olulist erinevust (P>0,05).
Muutunud mRNA ekspressioonimustri kinnitamiseks viidi läbi Western blot analüüs, kasutades kaubanduslikult saadaolevaid IL-4 ja IL-17 vastaseid antikehi. Nagu joonistel 5A ja B näidatud, olid IL-4 ja IL-17 valgutasemed NPE rühmas võrreldes ME rühma ja platseebo-operatsiooni rühmaga oluliselt suurenenud (P < 0,05). Võrreldes platseebo-operatsiooni rühmaga ei saavutanud IL-4 ja IL-17 valgutasemed ME rühmas samuti statistiliselt olulisi muutusi (P > 0,05).
(A) IL-4 ja IL-17 valgu tasemed NPE rühmas olid oluliselt kõrgemad kui ME rühmas ja platseeborühmas (P < 0,05). (B) Western blot histogramm.
Kuna operatsiooni käigus saadud inimproovide arv on piiratud, on selgete ja detailsete uuringute tegemine MC patogeneesi kohta mõnevõrra keeruline. Püüdsime luua MC loommudeli, et uurida selle võimalikke patoloogilisi mehhanisme. Samal ajal kasutati NP autotransplantaadi poolt indutseeritud MC kulgu jälgimiseks radioloogilist hindamist, histoloogilist hindamist ja molekulaarbioloogilist hindamist. Selle tulemusena muutus NP implanteerimismudel signaali intensiivsuses järkjärguliselt 12. nädalast 20. nädalani (segatud madal signaal T1W järjestustes ja madal signaal T2W järjestustes), mis viitab kudede muutustele, ning histoloogilised ja molekulaarbioloogilised hinnangud kinnitasid radioloogilise uuringu tulemusi.
Selle katse tulemused näitavad, et NPE rühmas ilmnesid selgroolüli kahjustuse kohas visuaalsed ja histoloogilised muutused. Samal ajal täheldati IL-4, IL-17 ja IFN-γ geenide, samuti IL-4, IL-17 ja IFN-γ ekspressiooni, mis viitab sellele, et autoloogse nucleus pulposus koe kahjustus selgroolülis võib põhjustada mitmeid signaali- ja morfoloogilisi muutusi. On lihtne leida, et loommudeli selgroolülide signaaliomadused (madal signaal T1W järjestuses, segasignaal ja madal signaal T2W järjestuses) on väga sarnased inimese selgroolülide omadega ning MRI omadused kinnitavad ka histoloogia ja üldise anatoomia vaatlusi, st muutused selgroolüli rakkudes on progresseeruvad. Kuigi ägeda trauma põhjustatud põletikuline reaktsioon võib ilmneda varsti pärast punktsiooni, näitasid MRI tulemused, et progresseeruvalt suurenevad signaalimuutused ilmnesid 12 nädalat pärast punktsiooni ja püsisid kuni 20 nädalat ilma taastumise või MRI muutuste pöördumise märkideta. Need tulemused viitavad sellele, et autoloogne lülisamba NP on usaldusväärne meetod progresseeruva MV loomiseks küülikutel.
See punktsioonimudel nõuab piisavaid oskusi, aega ja kirurgilist pingutust. Eelkatsetes võib paravertebraalsete sidemete struktuuride dissektsioon või liigne stimuleerimine põhjustada selgroolülide osteofüütide teket. Tuleb olla ettevaatlik, et mitte kahjustada ega ärritada külgnevaid kettaid. Kuna järjepidevate ja reprodutseeritavate tulemuste saamiseks tuleb tungimissügavust kontrollida, valmistasime käsitsi korgi, lõigates ära 3 mm pikkuse nõela tupe. Selle korgi kasutamine tagab selgroolüli ühtlase puurimissügavuse. Eelkatsetes leidsid kolm operatsioonis osalenud ortopeedilist kirurgi, et 16-kaliibriliste nõeltega on lihtsam töötada kui 18-kaliibriliste nõelte või muude meetoditega. Liigse verejooksu vältimiseks puurimise ajal tagab nõela mõnda aega paigal hoidmine sobivama sisestamisava, mis viitab sellele, et teatud määral saab lülisamba vigastust sel viisil kontrollida.
Kuigi paljud uuringud on keskendunud MC-le, on MC etioloogia ja patogeneesi kohta vähe teada25,26,27. Meie varasemate uuringute põhjal leidsime, et autoimmuunsusel on MC12 esinemises ja arengus võtmeroll. Käesolevas uuringus uuriti IL-4, IL-17 ja IFN-γ kvantitatiivset ekspressiooni, mis on CD4+ rakkude peamised diferentseerumisrajad pärast antigeeni stimulatsiooni. Meie uuringus oli NPE-rühmas negatiivse rühmaga võrreldes IL-4, IL-17 ja IFN-γ ekspressioon kõrgem ning IL-4 ja IL-17 valgutasemed olid samuti kõrgemad.
Kliiniliselt on IL-17 mRNA ekspressioon suurenenud NP-rakkudes ketasherniatsiooniga patsientidel28. Ägeda mittekompressiivse ketasherniatsiooni mudelis leiti ka IL-4 ja IFN-γ ekspressioonitasemete tõusu võrreldes tervete kontrollisikutega29. IL-17 mängib võtmerolli põletikus ja koekahjustuses autoimmuunhaiguste korral30 ning tugevdab immuunvastust IFN-γ suhtes31. IL-17 vahendatud koekahjustuse tugevnemist on täheldatud MRL/lpr hiirtel32 ja autoimmuunsusele vastuvõtlikel hiirtel33. IL-4 võib pärssida põletikuliste tsütokiinide (nagu IL-1β ja TNFα) ekspressiooni ja makrofaagide aktiveerimist34. On teatatud, et IL-4 mRNA ekspressioon oli NPE rühmas erinev võrreldes IL-17 ja IFN-γ-ga samal ajahetkel; IFN-γ mRNA ekspressioon NPE rühmas oli oluliselt kõrgem kui teistes rühmades. Seetõttu võib IFN-γ tootmine olla NP interkalatsiooni poolt indutseeritud põletikulise vastuse vahendaja. Uuringud on näidanud, et IFN-γ-d toodavad mitut tüüpi rakud, sealhulgas aktiveeritud 1. tüüpi T-abistajarakud, looduslikud tapjarakud ja makrofaagid35,36, ning see on peamine põletikuline tsütokiin, mis soodustab immuunvastuseid37.
See uuring viitab sellele, et MC esinemise ja arenguga võib olla seotud autoimmuunvastus. Luoma jt leidsid, et MC ja silmapaistva NP signaaliomadused on MRI-l sarnased ning mõlemad näitavad T2W järjestuses kõrget signaali38. On kinnitust leidnud, et mõned tsütokiinid on tihedalt seotud MC esinemisega, näiteks IL-139. Ma jt pakkusid välja, et NP üles- või allapoole eendumine võib oluliselt mõjutada MC12 esinemist ja arengut. Bobechko40 ja Herzbein jt41 teatasid, et NP on immunotolerantne kude, mis ei saa sünnist saati vereringesse siseneda. NP eendumine viib vereringesse võõrkehi, vahendades seeläbi lokaalseid autoimmuunreaktsioone42. Autoimmuunreaktsioonid võivad esile kutsuda suure hulga immuunfaktoreid ja kui need faktorid puutuvad pidevalt kudedega kokku, võivad need põhjustada muutusi signaaliülekandes43. Selles uuringus on IL-4, IL-17 ja IFN-γ üleekspressioon tüüpilised immuunfaktorid, mis tõestab veelgi NP ja MC-de vahelist lähedast seost44. See loommudel jäljendab hästi NP läbimurret ja sisenemist otsaplaati. See protsess näitas veelgi autoimmuunsuse mõju MC-le.
Nagu oodatud, pakub see loommudel meile võimaliku platvormi MC uurimiseks. Sellel mudelil on aga siiski mõned piirangud: esiteks tuleb loomade vaatlusfaasis mõned vahepealse staadiumi küülikud histoloogiliseks ja molekulaarbioloogiliseks testimiseks eutaneerida, mistõttu mõned loomad aja jooksul "langevad kasutusest". Teiseks, kuigi selles uuringus on seatud kolm ajapunkti, modelleerisime kahjuks ainult ühte MC tüüpi (Modic I tüüpi muutus), seega ei ole see piisav inimese haiguse arenguprotsessi esindamiseks ja kõigi signaalimuutuste paremaks jälgimiseks tuleb seada rohkem ajapunkte. Kolmandaks, koe struktuuri muutusi saab tõepoolest selgelt näidata histoloogilise värvimisega, kuid mõned spetsiaalsed tehnikad suudavad selles mudelis mikrostruktuurilisi muutusi paremini paljastada. Näiteks kasutati polariseeritud valgusmikroskoopiat küüliku lülivaheketaste fibrokartilli moodustumise analüüsimiseks45. NP pikaajaline mõju MC-le ja lõppplaadile vajab edasist uurimist.
Viiskümmend neli isast Uus-Meremaa valget küülikut (kaal umbes 2,5–3 kg, vanus 3–3,5 kuud) jagati juhuslikult platseebo-operatsiooni gruppi, lihasimplantatsiooni gruppi (ME grupp) ja närvijuure implantatsiooni gruppi (NPE grupp). Kõik katseprotseduurid kiitis heaks Tianjini haigla eetikakomitee ning katsemeetodid viidi läbi rangelt vastavalt kinnitatud suunistele.
S. Sobajima kirurgilises tehnikas on tehtud mõningaid täiustusi46. Iga küülik asetati külili lamavasse asendisse ja viie järjestikuse nimmelülidevahelise ketta (IVD) esipind paljastati posterolateraalse retroperitoneaalse lähenemise abil. Igale küülikule manustati üldnarkoosi (20% uretaan, 5 ml/kg kõrvaveeni kaudu). Ribide alumisest servast vaagnaääreni tehti pikisuunaline naha sisselõige, 2 cm ventraalselt paravertebraallihastest. Parempoolne anterolateraalne selgroog L1-st L6-ni paljastati pealmise nahaaluse koe, retroperitoneaalse koe ja lihaste terava ja nüri dissektsiooni teel (joonis 6A). Ketta tase määrati, kasutades vaagnaäärt L5-L6 ketta taseme anatoomilise orientiirina. Kasutage 16-kaliibrilist punktsioonnõela, et puurida L5 selgroolüli otsaplaadi lähedale 3 mm sügavune auk (joonis 6B). Kasutage 5 ml süstalt L1-L2 lülivaheketta autoloogse nucleus pulposus'e aspireerimiseks (joonis 6C). Eemaldage nucleus pulposus või lihas vastavalt iga rühma vajadustele. Pärast puuritud augu süvendamist asetatakse sügavale fastsiale, pindmisele fastsiale ja nahale imenduvad õmblused, jälgides, et operatsiooni ajal ei kahjustataks lülikeha periostaalset kude.
(A) L5–L6 ketas paljastatakse posterolateraalse retroperitoneaalse lähenemise kaudu. (B) Kasutage 16-kaliibrilist nõela, et puurida auk L5 otsaplaadi lähedale. (C) Autoloogsed MF-id kogutakse.
Üldanesteesia manustati 20% uretaaniga (5 ml/kg), mis manustati kõrvaveeni kaudu, ja nimmelülide röntgenülesvõtteid korrati 12., 16. ja 20. nädalal pärast operatsiooni.
Küülikud hukati ketamiini (25,0 mg/kg) intramuskulaarse süstimise ja naatriumpentobarbitaali (1,2 g/kg) intravenoosse süstimise teel 12, 16 ja 20 nädalat pärast operatsiooni. Histoloogiliseks analüüsiks eemaldati kogu selgroog ja teostati tegelik analüüs. Immuunfaktorite muutuste tuvastamiseks kasutati kvantitatiivset pöördtranskriptsiooni (RT-qPCR) ja Western blot analüüsi.
Küülikutel tehti MRI-uuringud, kasutades 3,0 T kliinilist magnetit (GE Medical Systems, Florence, SC), mis oli varustatud ortogonaalse jäsememähise vastuvõtjaga. Küülikud tuimestati 20% uretaaniga (5 ml/kg) kõrvaveeni kaudu ja seejärel asetati nad magneti sisse selili, nimmepiirkond oli tsentreeritud 5-tollise läbimõõduga ümmarguse pinnamähise peale (GE Medical Systems). Nimmeketta asukoha määramiseks L3–L4 kuni L5–L6 saadi koronaalsed T2-kaalutud lokalisaatori kujutised (TR, 1445 ms; TE, 37 ms). Sagitaalse tasandi T2-kaalutud viilud saadi järgmiste sätetega: kiire spinn-kaja järjestus kordusajaga (TR) 2200 ms ja kajaajaga (TE) 70 ms, maatriks; nägemisväli 260 ja kaheksa stiimulit; lõikepaksus oli 2 mm, vahe oli 0,2 mm.
Pärast viimase foto tegemist ja viimase küüliku tapmist eemaldati histoloogiliseks uuringuks platseebo-, lihasesse kinnitunud ja NP-kettad. Koed fikseeriti 1 nädal 10% neutraalses puhverdatud formaldehüüdis, dekaltsifitseeriti etüleendiamiintetraäädikhappega ja lõigati parafiinist lõigud. Koeplokid kinnistati parafiini ja lõigati mikrotoomi abil sagitaalseteks lõikudeks (5 μm paksused). Lõigud värviti hematoksüliini ja eosiiniga (H&E).
Pärast iga rühma küülikute lülidevaheliste ketaste kogumist ekstraheeriti totaalne RNA UNIQ-10 kolonni (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Hiina) abil vastavalt tootja juhistele ja ImProm II pöördtranskriptsioonisüsteemi (Promega Inc., Madison, WI, USA) abil. Viidi läbi pöördtranskriptsioon.
RT-qPCR viidi läbi Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) ja SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) abil vastavalt tootja juhistele. PCR reaktsioonisegu maht oli 20 μl ja see sisaldas 1,5 μl lahjendatud cDNA-d ja 0,2 μM iga praimerit. Praimerid disainis OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) ja tootis Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Hiina) (tabel 1). Kasutati järgmisi termotsükleerimise tingimusi: esialgne polümeraasi aktiveerimisetapp temperatuuril 94 °C 2 minutit, seejärel 40 tsüklit 15 sekundit igaüks temperatuuril 94 °C matriitsi denatureerimiseks, 1-minutiline anniilimine temperatuuril 60 °C, pikendamine ja fluorestsents. Mõõtmised viidi läbi 1 minuti jooksul temperatuuril 72 °C. Kõiki proove amplifitseeriti kolm korda ja RT-qPCR analüüsiks kasutati keskmist väärtust. Amplifikatsiooniandmeid analüüsiti FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) abil. IL-4, IL-17 ja IFN-γ geeniekspressioon normaliseeriti endogeense kontrolli (ACTB) suhtes. Siht-mRNA suhtelised ekspressioonitasemed arvutati 2-ΔΔCT meetodi abil.
Koguvalk ekstraheeriti kudedest kudede homogenisaatori abil RIPA lüüsipuhvris (mis sisaldas proteaasi ja fosfataasi inhibiitorite kokteili) ja seejärel tsentrifuugiti kiirusel 13 000 p/min 20 minutit temperatuuril 4 °C, et eemaldada koejäätmed. Igale rajale laaditi 50 mikrogrammi valku, need eraldati 10% SDS-PAGE abil ja kanti seejärel PVDF membraanile. Blokeerimine viidi läbi 5% rasvavabas piimapulbris Tris-puhverdatud soolalahuses (TBS), mis sisaldas 0,1% Tween 20, 1 tund toatemperatuuril. Membraani inkubeeriti küüliku dekoriinivastase primaarse antikehaga (lahjendatud 1:200; Boster, Wuhan, Hiina) (lahjendatud 1:200; Bioss, Peking, Hiina) üleöö temperatuuril 4 °C ja reageeriti teisel päeval sekundaarse antikehaga (kitse küülikuvastane immunoglobuliin G lahjenduses 1:40 000) koos mädarõikaperoksidaasiga (Boster, Wuhan, Hiina) 1 tund toatemperatuuril. Western blot signaalid tuvastati kemoluminestsentsmembraanil pärast röntgenikiiritamist suurenenud kemoluminestsentsi abil. Densitomeetriliseks analüüsiks skaneeriti blotid ja kvantifitseeriti BandScan tarkvara abil ning tulemused väljendati sihtgeeni immunoreaktiivsuse ja tubuliini immunoreaktiivsuse suhtena.
Statistilised arvutused tehti SPSS16.0 tarkvarapaketiga (SPSS, USA). Uuringu käigus kogutud andmed väljendati keskmisena ± standardhälve (keskmine ± SD) ja analüüsiti kahe rühma vaheliste erinevuste kindlakstegemiseks ühesuunalise korduvmõõtmiste dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil. P < 0,05 loeti statistiliselt oluliseks.
Seega võib MC loommudeli loomine autoloogsete NP-de implanteerimise teel selgroolüli kehasse ning makroanatoomilise vaatluse, MRI-analüüsi, histoloogilise hindamise ja molekulaarbioloogilise analüüsi teostamise teel saada oluliseks vahendiks inimese MC mehhanismide hindamisel ja mõistmisel ning uute terapeutiliste sekkumiste väljatöötamisel.
Kuidas seda artiklit tsiteerida: Han, C. jt. Modici muutuste loommudel loodi autoloogse nucleus pulposuse implanteerimise teel nimmelülide subhondraalsesse luusse. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. ja Boos, N. Nimmelülide magnetresonantstomograafia: ketta herniatsiooni ja retentsiooni, närvijuurte kokkusurumise, otsaplaatide anomaaliate ja faseetliigese osteoartriidi levimus asümptomaatilistel vabatahtlikel. Radioloogia 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS ja Leboeuf-Eed, K. Moodilised muutused ja nende seos kliiniliste leidudega. European Spine Journal: Euroopa Selgrooühingu, Euroopa Selgroo Deformatsioonide Ühingu ja Euroopa Kaelalülide Uurimise Ühingu ametlik väljaanne 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. jt. Nimmelülide otsaplaatide modaalsed muutused: levimus ja seos alaseljavalu ja ishiasega keskealistel meestöötajatel. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. ja Dalinka, M. Luuüdi muutuste magnetresonantstomograafia (MRI) nimmelülide degeneratiivse haiguse korral otsaplaadi lähedal. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ ja Carter, JR. Degeneratiivne ketashaigus: lülisamba luuüdi muutuste hindamine magnetresonantstomograafiaga (MRI). Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS ja Carter, JR. Degeneratiivse ketashaiguse kuvamine. Radioloogia 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS jt. Neovertebraalse lõppplaadi (Modic) signaali muutuste ennustajad üldpopulatsioonis. European Spine Journal: Euroopa Selgrooühingu, Euroopa Selgroo Deformatsiooni Ühingu ja Euroopa Kaelalülide Uurimise Ühingu ametlik väljaanne, 19. osakond, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB ja Mannisch, K. Nimmelülidevahelise ketta songa järgsed muutused. European Spine Journal: Euroopa Selgrooühingu, Euroopa Selgroo Deformatsioonide Ühingu ja Euroopa Kaelalülide Uurimise Ühingu ametlik väljaanne 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. ja Kaapa, E. Modilised I tüüpi muutused võivad ennustada kiiresti progresseeruvat deformatsioonilist ketasdegeneratsiooni: üheaastane prospektiivne uuring. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ ja Fan, SW. Modilised muutused: nimmelülide degeneratsiooni võimalikud põhjused ja panus. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Sisemise ketta rebend. Ketta prolapsi probleemid üle 50 aasta. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Postituse aeg: 13. detsember 2024