Täname, et külastasite Nature.com. Teie kasutatava brauseri versioonil on piiratud CSS -tugi. Parimate tulemuste saamiseks soovitame teil kasutada oma brauseri uuemat versiooni (või keelata ühilduvusrežiim Internet Exploreris). Vahepeal kuvame pideva toe tagamiseks saiti ilma stiili või JavaScriptita.
Haavade mikroobide kasv avaldub sageli biokiledena, mis häirivad paranemist ja mida on raske likvideerida. Uued hõbedased kastmed väidavad, et võitlevad haavainfektsioonide vastu, kuid nende antibiofilmi efektiivsus ja nakkusest sõltumatu paranemismõju pole üldiselt teada. Kasutades Staphylococcus aureus ja Pseudomonas aeruginosa in vitro ja in vivo biokile mudeleid, teatame AG1+ ioonide genereerivate kastmete tõhususest; AG1+ etüleendiamiinideteraäädhapete ja bensetooniumkloriidi (Ag1+/EDTA/BC) ja katted, mis sisaldavad hõbeninitraati (Ag oksüsalte). , mis toodavad Ag1+, AG2+ ja Ag3+ ioonid haava biokile ja selle mõju paranemisele. AG1+ kaste oli minimaalne mõju haava biokile in vitro ja hiirtel (C57BL/6J). Seevastu hapnikuga varustatud Ag -soolad ja Ag1+/EDTA/BC katted vähendasid märkimisväärselt biokilede elujõuliste bakterite arvu in vitro ja näitasid bakterite ja EPS komponentide olulist vähenemist hiirehaavade biokiledes. Nendel sidemetel oli erinev mõju biokilega nakatunud ja mitte-biofilmiga nakatunud haavade paranemisele, hapnikuga rikastatud soolakatted avaldasid kasulikumat mõju repitelialiseerimisele, haava suurusele ja põletikule võrreldes kontrollravi ja muude hõbedaste riietustega. Hõbedaste kastmete erinevatel füüsikalis-keemilistel omadustel võib olla haava biokile ja paranemine erinev ning seda tuleks kaaluda kastme valimisel biokilega nakatunud haavade raviks.
Kroonilised haavad on määratletud kui „haavad, mis ei jõua paranemise normaalsete etappide kaudu korrapäraselt ja õigeaegselt” 1. Kroonilised haavad loovad patsientidele ja tervishoiusüsteemile psühholoogilise, sotsiaalse ja majandusliku koormuse. Aastased NHS -i kulutused haavade ja sellega seotud kaasuvate haiguste ravimiseks on hinnanguliselt 8,3 miljardit naela aastatel 2017–182. Kroonilised haavad on praegu ka Ameerika Ühendriikides pakilise probleem, kusjuures Medicare hinnas aastaseid kulusid haavadega patsientide raviks 28,1–96,8 miljardit dollarit.
Infektsioon on peamine tegur, mis takistab haavade paranemist. Infektsioonid avalduvad sageli biokiledena, mis esinevad 78% -l mitte-paranevatest kroonilistest haavadest. Biokiled moodustuvad siis, kui mikroorganismid muutuvad pöördumatult pindadele, näiteks haavapindadele, ja need võivad agregeeruda, moodustades rakuvälise polümeeri (EPS) tootvad kogukonnad. Haava biokile seostatakse suurenenud põletikulise vastusega, mis põhjustab kudede kahjustusi, mis võib paranemist edasi lükata või vältida. Kudede kahjustuste suurenemine võib olla osaliselt tingitud maatriksi metalloproteinaaside, kollagenaasi, elastaasi ja reaktiivse hapnikuliiki suurenenud aktiivsusest5. Lisaks on põletikulised rakud ja biokiled ise hapniku kõrged tarbijad ja võivad seetõttu põhjustada kudede kohalikku hüpoksiat, kahandades koe efektiivseks parandamiseks vajaliku elutähtsa hapniku rakke.
Küpsed biokiled on antimikroobsete ainete suhtes väga vastupidavad, nõudes biokilenakkuste kontrollimiseks agressiivseid strateegiaid, näiteks mehaaniline ravi, millele järgneb tõhus antimikroobne ravi. Kuna biokiled võivad kiiresti taastuda, võivad tõhusad antimikroobsed ained vähendada pärast kirurgilist debridementi.
Hõbedat kasutatakse üha enam antimikroobsetes kastmistes ja seda kasutatakse sageli krooniliste nakatunud haavade esmavalikuna. Seal on palju kaubanduslikult saadaval hõbedaid, millest igaüks sisaldab erinevat hõbedast koostist, kontsentratsiooni ja alusmaatriksit. Hõbedaste käepaelte edusammud on viinud uute hõbedaste käepaelte arendamiseni. Hõbemetalliline vorm (AG0) on inertne; Antimikroobse efektiivsuse saavutamiseks peab see kaotama elektroni ioonse hõbeda (AG1+) moodustamiseks. Traditsioonilised hõbedased kastmed sisaldavad hõbedaseid ühendeid või metallilist hõbedat, mis vedelikuga kokkupuutel lagunevad, moodustades Ag1+ ioonid. Need AG1+ ioonid reageerivad bakterrakuga, eemaldades elektronid struktuurikomponentidest või elulemuse jaoks vajalikud kriitilised protsessid. Patenteeritud tehnoloogia on viinud uue hõbeühendi Ag Oxysalts (hõbenitraat, Ag7NO11) arendamiseni, mis on kaasas haavasidemeid. Erinevalt traditsioonilisest hõbedast tekitab hapnikku sisaldavate soolade lagunemine kõrgema valentsusega hõbeda olekuid (AG1+, AG2+ja AG3+). In vitro uuringud on näidanud, et hapnikuga varustatud hõbedaste soolade madalad kontsentratsioonid on efektiivsemad kui üksik ioonhõbe (AG1+) patogeensete bakterite, näiteks Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ja Escherichia coli8,9 suhtes. Veel üks uut tüüpi hõbedane kaste sisaldab täiendavaid koostisosi, nimelt etüleendiaminetetraäädikhapet (EDTA) ja bensetooniumkloriidi (BC), mis teatatakse, et see on suunatud biokile EPS -ile ja suurendavad seeläbi hõbeda tungimist biofilmi. Need uued hõbetehnoloogiad pakuvad uusi võimalusi haava biokilede sihtimiseks. Kuid nende antimikroobikute mõju haavakeskkonnale ja infektsioonist sõltumatule paranemisele on oluline tagada, et need ei looks ebasoodsat haavakeskkonda ega viivitust. Muredest in vitro hõbeda tsütotoksilisuse pärast on teatatud mitme hõbedase kastmega10,11. Kuid in vitro tsütotoksilisus ei ole veel in vivo toksilisust tõlgitud ja mitmed AG1+ katted on näidanud head ohutusprofiili12.
Siin uurisime karboksümetüültselluloossidemete tõhusust, mis sisaldas uudseid hõbeda preparaate haava biokile vastu in vitro ja in vivo. Lisaks hinnati nende kaste mõju immuunvastusele ja infektsioonist sõltumatu paranemisele.
Kõik kasutatud kastmed olid kaubanduslikult saadaval. 3M Kerraceli geelkiudude kaste (3M, Knutsford, Suurbritannia) on mittesiidiline 100% karboksümetüültulloos (CMC) geelkiudu, mida kasutati kontrollkastmena selles uuringus. Hinnati kolme antimikroobset CMC hõbedast kastmeid, nimelt 3M Kerracel AG kaste (3M, Knutsford, Suurbritannia), mis sisaldab 1,7 massiprotsenti. Hapnikuga rikastatud hõbe sool (Ag7NO11) kõrgema valentsusega hõbedaioonides (AG1+, AG2+ja AG3+). AG7NO11 lagunemise ajal moodustuvad AG1+, AG2+ ja AG3+ ioonid suhtega 1: 2: 4. Veevala Ag lisakaste, mis sisaldab 1,2% hõbekloriidi (AG1+) (Convatec, Deeside, Suurbritannia) 13 ja vesivank Ag+lisakaste, mis sisaldavad 1,2% hõbekloriidi (AG1+), EDTA ja bensetooniumkloriid (Contarec, Deeside, Suurbritannia) 14.
Selles uuringus kasutatud tüvedeks olid Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (rahvatervise Inglismaa, Salisbury) ja Staphylococcus aureus NCTC 6571 (rahvatervise Inglismaa, Salisbury).
Baktereid kasvatati üleöö Muller-Hintoni puljongis (Oxoid, Altrincham, Suurbritannia). Seejärel lahjendati üleöö kultuur 1: 100 Mueller-Hintoni puljongis ja 200 ui pidas steriilse 0,2 µm Whatman Cyclopore membraanid (Whatman Plc, Maidstone, Suurbritannia) Mueller-Hinton Agar Platsile (Sigma-Aldrich Company, Kent, Suurbritannia, Suurbritannia, Suurbritannia ). ) Koloonia biokile moodustumine temperatuuril 37 ° C 24 tundi. Neid koloonia biokilesid testiti logaritmilise kokkutõmbumise suhtes.
Lõigake kaste 3 cm2 ruudukujuliseks tükiks ja eelmoistenist steriilse deioniseeritud veega. Asetage side koloonia biokile agariplaadile. Iga 24 ha biokile eemaldati ja elujõulised bakterid biokile (CFU/ml) kvantifitseeriti jada lahjendamise (10–1–10–7) abil päevanurga neutraliseerimispuljongis (Merck-Millipore). Pärast 24-tunnist inkubeerimist temperatuuril 37 ° C viidi Mueller-Hinton agariplaatidel läbi standardplaadide arv. Iga töötlemine ja ajapunkt viidi läbi kolmes eksemplaris ning iga lahjenduse korral korrati plaatide arvu.
Sealiha kõhunahk saadakse naiste suurte valgete sigadelt 15 minuti jooksul pärast tapmist vastavalt Euroopa Liidu ekspordistandarditele. Nahk raseeriti ja puhastati alkoholilappidega, seejärel külmutati naha delistimiseks 24 tundi temperatuuril -80 ° C. Pärast sulatamist pesti kolm korda 1 cm2 nahatükke PBS -iga, 0,6% naatriumhüpokloriti ja 70% etanooliga iga kord 20 minutit. Enne epidermise eemaldamist eemaldage ülejäänud etanool, pestes 3 korda steriilses PBS -is. Nahka kultiveeriti 6-süvendilises plaadil, mille peal oli 0,45 μm paksune nailonmembraan (Merck-Millipore) ja 3 neeldunud padja (Merck-Millipore), mis sisaldas 3 ml loote veise seerumit (Sigma), millele on lisatud 10% Dulbecco modifitseeritud modifitseeritud Kotkas. Keskmine (Dulbecco modifitseeritud Eagle sööde - Aldrich Ltd.).
Koloonia biokilesid kasvatati vastavalt biokile kokkupuute uuringutele. Pärast biokile kultiveerimist membraanil 72 tundi, kanti biokile nahapinnale, kasutades steriilset inokuleerimissilmust ja membraan eemaldati. Seejärel inkubeeriti biokile siga dermile veel 24 tundi temperatuuril 37 ° C, et biokile saaks küpseda ja kleepuda sea nahale. Pärast biokile küpsemist ja kinnitumist kanti 1,5 cm2 kaste, mis oli eelnevalt hoisteeritud steriilse destilleeritud veega, otse nahapinnale ja inkubeeriti 24 tundi temperatuuril 37 ° C. Elujõulised bakterid visualiseeriti värvimisega, rakendades ühtlaselt rakkude elujõulisuse reagenti (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Suurbritannia) iga eksplantaadi apikaalsele pinnale ja inkubeerides seda 5 minutit. Kasutage Leica MZ8 mikroskoobi piltide koheseks jäädvustamiseks Leica DFC425 digitaalkaamerat. Värviline roosa kvantifitseeriti Image Pro tarkvara versiooni 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (Mediacy.com)). Skaneeriv elektronmikroskoopia viidi läbi vastavalt allpool kirjeldatule.
Üleöö kasvatatud bakterid lahjendati Mueller-Hintoni puljongis 1: 100. Steriilsele 0,2 μm Whatman Cyclopore membraanile (Whatman, Maidstone, Suurbritannia) lisati 200 μl kultuuri ja pindati Mueller-Hinton Agaril. Biokileplaate inkubeeriti temperatuuril 37 ° C 72 tundi, et võimaldada küpset biokile moodustumist.
Pärast 3 -päevast biokile küpsemist pandi 3 cm2 ruut sideühendus otse biokile ja inkubeeriti 24 tundi temperatuuril 37 ° C. Pärast sidemete eemaldamist biokile pinnalt lisati iga biokile pinnale 1 ml prestoblue rakkude elujõulisuse reagenti (Invitrogen, Waltham, MA). Pinnad kuivatati enne värvimuutuste registreerimist, kasutades Nikon D2300 digitaalkaamerat (Nikon UK Ltd., Kingston, Suurbritannia).
Valmistage üleöö kultuurid Mueller-Hinton Agaril, viige üksikud kolooniad 10 ml Mueller-Hintoni puljongiks ja inkubeerige raputajal temperatuuril 37 ° C (100 p / min). Pärast üleöö inkubeerimist lahjendati kultuur 1: 100 Mueller-Hintoni puljongis ja 300 ui märgati 0,2 um ümmargusele Whatman Cyclopore membraanile (Whatman International, Maidstone, Suurbritannia) Mueller-Hinton Agar ja inkubeeriti temperatuuril 37 ° C 72 tunni jooksul 72 tunni jooksul 37 ° C. . . Küps biokile rakendati haavale, nagu allpool kirjeldatud.
Kõik tööd loomadega viidi läbi Manchesteri ülikoolis projektilitsentsi alusel, mille on heaks kiitnud loomade heaolu ja eetilise ülevaate büroo (lk 8721bd27) ning vastavalt juhistele, mille koduosakond avaldas 2012. aasta muudetud ASPA alusel. Kõik autorid järgisid saabumisjuhiseid. Kõigi in vivo uuringute jaoks kasutati kaheksanädalast C57BL/6J hiiri (Envigo, Oxon, Suurbritannia). Hiired tuimastati isofluraaniga (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Suurbritannia) ning nende seljapinnad raseeriti ja puhastati. Seejärel anti igale hiirele Stiefel Biopsy Punch (Schuco International, Hertfordshire, Suurbritannia) abil 2 × 6 mm ekstsisioonihaav. Biokilega nakatunud haavade korral kandke membraanil kasvatatud 72-tunnine koloonia biokile, nagu eespool kirjeldatud haava nahakihiks, kasutades steriilset nakatamise ahelat kohe pärast vigastust ja visake membraan ära. Niiske haavakeskkonna säilitamiseks on üks ruut sentimeeter kastet eelnevalt steriilse veega. Katteid kanti otse igale haavale ja kaeti 3M tegadermi kilega (3M, Bracknell, Suurbritannia) ja mastisol vedel liimiga (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) kanti servade ümber täiendava adhesiooni tagamiseks. Buprenorfiini (AnimalCare, York, Suurbritannia) manustati analgeetilisena kontsentratsioonil 0,1 mg/kg. Kolm päeva pärast vigastust, kasutades 1. loendi meetodit, eemaldage, eraldage, vähendage ja hoidke haavapiirkonda vastavalt vajadusele.
Hematoksüliin (Thermofisher Scientific) ja eosiin (Thermofisher Scientific) värvimine viidi läbi vastavalt tootja protokollile. Haavaala ja repitelialiseerimine kvantifitseeriti, kasutades Image Pro tarkvara versiooni 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Kudede lõigud olid ksüleeni (Thermofisher Scientific, Loughborough, Suurbritannia), rehüdreeriti 100–50% astmega etanooliga ja sukeldati lühidalt deioniseeritud vette (Thermofisher Scientific). Immunohistokeemia viidi läbi Vectastain Elite ABC PK-6104 komplekti (Vector Laboratories, Burlingame, CA) järgi vastavalt tootja protokollile. Primaarsed antikehad neutrofiilide NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) ja makrofaagid MS CD107B Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, UK) lahjendati 1: 100 blokeerimislahuses ja lisati lõigatud pinnale, millele järgnes 2 antikeha Antikehat ABC ja Vector Nova Red peroksüdaasi (HRP) substraadi komplekt (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ja vastupidiselt hematoksüliiniga. Pildid saadi Olympus BX43 mikroskoobi ja Olympus DP73 digitaalkaamera abil (Olympus, Southend-on-Sea, Suurbritannia).
Nahaproovid fikseeriti 2,5% glutaraldehüüdis ja 4% formaldehüüd 0,1 m HEPES (pH 7,4) 24 tundi temperatuuril 4 ° C. Proovid dehüdreeriti klassifitseeritud etanooli abil ja kuivatati CO2-s, kasutades kvoorum K850 kriitilise punkti kuivati (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Suurbritannia) ja Gold-Palladiumi sulamiga kaetud pritsimisprits, kasutades Quorum SC7620 minipipi/hõõglahendussüsteemi. Proovid kasutati haava keskpunkti visualiseerimiseks FEI Quanta 250 skaneeriva elektronmikroskoobi (Thermofisher Scientific) abil.
TOTO-1 jodiidi (2 μM) kanti lõigatud hiirehaava pinnale ja inkubeeriti 5 minutit temperatuuril 37 ° C (Thermofisher Scientific) ja töödeldi SYTO-60 (10 μM) abil temperatuuril 37 ° C (Termofisher Scientific). Leica TCS SP8 abil loodi 15-minutilised Z-virnapildid.
Bioloogilisi ja tehnilisi kordusandmeid taberiti ja analüüsiti, kasutades tarkvara GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Iga töötlemise ja mitte-antimikroobse kontrollkastme erinevuste testimiseks kasutati Dunnetti post hoc testi abil mitmete võrdlustega dispersiooni analüüsi. P väärtust <0,05 peeti oluliseks.
Hõbegeeli kiuliste kastmete tõhusust hinnati kõigepealt Staphylococcus aureus ja Pseudomonas aeruginosa biokile kolooniate suhtes in vitro. Hõbedased kastmed sisaldavad erinevaid hõbeda valemeid: traditsioonilised hõbedased kastmed annavad AG1+ ioone; Hõbedad, mis võivad pärast EDTA/BC lisamist Ag1+ ioone toota, võivad hävitada biokile maatriksi ja paljastada hõbeda all bakterid hõbedaks. ioonid15 ja kastmed, mis sisaldavad hapnikuga varustatud AG -soola, mis toodavad AG1+, AG2+ ja AG3+ ioone. Selle tõhusust võrreldi geelistatud kiududest valmistatud mitte-antimikroobse kontrollkastmega. Ülejäänud elujõulisi baktereid biokile hinnati iga 24 tunni järel 8 päeva jooksul (joonis 1). 5. päeval reastati biokile uuesti 3,85 × 105S -ga. Staphylococcus aureus või 1,22 × 105p. Aeruginosa biokile taastumise hindamiseks. Võrreldes mitte-antimikroobsete kontrollikatetega oli AG1+ kastmed minimaalselt mõjutatud bakterite elujõulisusele Staphylococcus aureus ja Pseudomonas aeruginosa biokiledes 5 päeva jooksul. Seevastu hapnikuga varustatud Ag ja Ag1 + + EDTA/BC soolasid sisaldavad riided olid efektiivsed bakterite tapmisel biokile 5 päeva jooksul. Pärast korduvat inokuleerimist 5. päeval planktoniliste bakteritega ei täheldatud biokile taastamist (joonis 1).
Staphylococcus aureus ja Pseudomonas aeruginosa biokilede elujõuliste bakterite kvantifitseerimine pärast hõbedaste kastmistega töötlemist. Staphylococcus aureuse ja Pseudomonas aeruginosa biokile kolooniaid töödeldi hõbedaste kastmete või mitte-antimikroobsete kontrollikatetega ning järelejäänud elujõuliste bakterite arv määrati iga 24 tunni järel. 5 päeva pärast reasiti biokile uuesti 3,85 × 105S -ga. Staphylococcus aureus või 1,22 × 105p. Biokile taastumise hindamiseks moodustati individuaalselt bakterioplanktoni pseudomonas aeruginosa kolooniad. Graafikud näitavad keskmist +/- standardviga.
Hõbedaste kastmete mõju visualiseerimiseks biokile elujõulisusele kanti kastmeid küpsele biokile, mida kasvatati seanahal ex vivo. 24 tunni pärast eemaldatakse kaste ja biokile värvitakse sinise reaktiivse värvainega, mis metaboliseeritakse elavate bakteritega roosa värviga. Kontrollsidemetega töödeldud biokiled olid roosad, mis näitab elujõuliste bakterite olemasolu biokile (joonis 2A). Seevastu ag -oksüsoolide kastmega töödeldud biokile oli peamiselt sinine, mis näitab, et ülejäänud naha pinnal olevad bakterid olid elujõulised bakterid (joonis 2B). Segatud sinist ja roosat värvust täheldati AG1+ sisaldavate kastmetega töödeldud biokiledes, mis näitab elujõuliste ja elujõuliste bakterite olemasolu biokile (joonis 2C), samas kui AG1+ sisaldavad EDTA/BC kastmed olid valdavalt sinised mõne roosa laikuga. tähistades piirkondi, mida hõbedane kaste ei mõjuta (joonis 2D). Aktiivsete (roosade) ja passiivsete (siniste) alade kvantifitseerimine näitas, et kontrollplaaster oli aktiivne 75% (joonis 2E). AG1 + + EDTA/BC katted toimisid sarnaselt hapnikuga varustatud Ag soolakattega, ellujäämise määr vastavalt 13% ja 14%. AG1+ kaste vähendas ka bakterite elujõulisust 21%. Seejärel täheldati neid biokilesid skaneeriva elektronmikroskoopia (SEM) abil. Pärast töötlemist kontrollikastmega ja Ag1+ kastmega täheldati seajuhtide aeruginosa kihti, mis kattis seanahka (joonis 2F, H), samas kui pärast töötlemist Ag1+ kastmega leiti vähe bakterirakke ja selle alt leiti vähe bakterirakke. Kollageeni kiude võib pidada seanaha kudede struktuuriks (joonis 2G). Pärast töötlemist Ag1 + + EDTA/BC -kastmega olid nähtavad bakteriaalsed naastud ja selle aluseks olevad kollageenikiud naastud (joonis 2I).
Pseudomonas aeruginosa biokile visualiseerimine pärast hõbeda riietumist. (A-D) Bakteriaalne elujõulisus Pseudomonas aeruginosa biokiledes, mida kasvatati seade nahal, visualiseeriti Prestoblue elujõulisuse värvaine abil 24 tundi pärast töötlemist hõbedaste ja mitte-antimikroobsete kontrollikatetega. Elavad bakterid on roosad, elujõuline bakterid ja siganahk on sinised. (E) Pseudomonas aeruginosa biokilede kvantifitseerimine, mis on kasvatatud seanahal (roosa koht), kasutades skaneeriva elektronmikroskoopia Image PRO versiooni 10 (FI) ja töödeldi hõbedase kastme või mitte-antimikroobse juhtimiskastmega 24 tundi. SEM skaala riba = 5 µm. (J - M) Koloniaalbiokiled kasvasid filtritel ja värviti pärast 24 -tunnist hõbedaste kastmete inkubeerimist Prestoblue reaktiivse värvainega.
Et teha kindlaks, kas kaste ja biokilede vahelised tihedad kontaktid mõjutasid kaste tõhusust, töödeldi tasasele pinnale asetatud koloonia biokile 24 tundi ja värviti seejärel reaktiivsete värvainetega. Ravimata biokile oli tumeroosa värvusega (joonis 2J). Vastupidiselt hapnikuga varustatud Ag -soola sisaldavate kastmetega töödeldud biokiledele (joonis 2K) näitasid AG1+ või AG1++ EDTA/BC -ga kastetega töödeldud biokiled roosa värvimise ribasid (joonis 2L, M). See roosa värvus näitab elujõuliste bakterite olemasolu ja on seotud kastme õmbluspiirkonnaga. Need õmmeldud alad loovad surnud ruumid, mis võimaldavad biokile baktereid ellu jääda.
Hõbedaste kastmete tõhususe hindamiseks in vivo töödeldi täiskohaga hiirte haavad, mis olid nakatunud küpse S. aureuse ja P. aeruginosa biokiledega mitte-antimikroobsete kontrollikastete või hõbedaste kastetega. Pärast 3-päevast töötlemist näitas makroskoopiline pildianalüüs hapnikuga varustatud soolakattega töödeldud väiksemaid haavade suurusi, võrreldes mitte-antimikroobsete kontrollikaste ja muude hõbedaste kastmete abil (joonis 3A-H). Nende tähelepanekute kinnitamiseks koristati haavad ja haavade pindala ja repitelialiseerumine kvantifitseeriti hematoksüliini ja eosiiniga värvitud koe lõikudel, kasutades Image Pro tarkvara versiooni 10 (joonis 3I-L).
Hõbedaste kastmete mõju haavapinnale ja biokiledega nakatunud haavade uuesti epitelialiseerumine. (A - H) Pseudomonas aeruginosa (A - D) ja Staphylococcus aureus (E - H) nakatunud väikesed rakud pärast kolmepäevast töötlemist mitte -antimikroobse kontrollikastmega, hapnikuga varustatud Ag -soolakastmega, Ag1+ ja Ag -kastmega ja Ag Ag+ kastmega ja Ag Ag -kastmega ja Ag Ag. riietumine. Esinduslikud makroskoopilised pildid. AG1 + + EDTA/BC kastmega hiirte haavad. (IL) esinduslik Pseudomonas aeruginosa infektsioon, hematoksüliini ja eosiiniga värvitud histoloogilised lõigud, mida kasutatakse haavapindala ja epiteeli regenereerimise kvantifitseerimiseks. Pseudomonas aeruginosa (M, N) ja Staphylococcus aureus (O, P) biokilede (Per ravirühma N = 12) nakatunud haavapindala (M, O) ja haavade pindala (n, p) kvantifitseerimine. Graafikud näitavad keskmist +/- standardviga. * tähendab p = <0,05 ** tähendab p = <0,01; Makroskoopiline skaala = 2,5 mm, histoloogiline skaala = 500 um.
Pseudomonas aeruginosa biokilega nakatunud haavade kvantifitseerimine (joonis 3M) näitasid, et ag-oksüsalatsioonidega töödeldud haavade keskmine haava suurus oli 2,5 mm2, samas Tõsi. saavutatud statistiline tähtsus (joonis 3M). p = 0,423). AG1+ või AG1++ EDTA/BC -ga töödeldud haavad ei näidanud haavapindala vähenemist (vastavalt 3,1 mm2 ja 3,6 mm2). Ravi hapnikuga rikastatud Ag soolakastmega soodustas uuesti epiteelialiseerumist kui mitte-antimikroobse kontrollikastmega (vastavalt 34% ja 15%; P = 0,029) ja AG1+ või AG1+++ EDTA/BC (10% ja 11%) (10% ja 11%) (10% ja 11%) ( Joonis 3N). . , vastavalt).
Sarnaseid suundumusi haavapiirkonnas ja epiteeli regenereerimisel täheldati S. aureuse biokiledega nakatunud haavades (joonis 3o). Hapnikuga varustatud hõbedast soola sisaldavad riided vähendasid haavapinda (2,0 mm2) 23% võrreldes kontroll-mitte-antimikroobse kastmega (2,6 mm2), ehkki see vähenemine polnud oluline (p = 0,304) (joonis 3o). Lisaks vähenes AG1+ ravirühmas haavapiirkond pisut (2,4 mm2), samas kui AG1++ EDTA/BC -kastmega töödeldud haav ei vähendanud haavapinda (2,9 mm2). Ag hapnikusoolad soodustasid ka S. aureuse biokilega nakatunud haavade uuesti epitelialiseerimist (31%) suuremal määral kui mitte antimikroobsete kontrollikatetega ravitud (12%, p = 0,003) (joonis 3P). AG1+ kaste (16%, p = 0,903) ja Ag+ 1+ EDTA/BC kaste (14%, p = 0,965) näitasid epiteeli regenereerimise taset, mis sarnanes kontrolliga.
Hõbedaste kaste mõju visualiseerimiseks biokile maatriksile viidi läbi Toto 1 ja Syto 60 jodiidi värvimine (joonis 4). TOTO 1 jodiid on rakkude läbisõol, mida saab kasutada rakuväliste nukleiinhapete täpseks visualiseerimiseks, mida on rikkalik biokilede EPS-is. SYTO 60 on raku läbilaskv värvaine, mida kasutatakse vastandina16 -na. TOTO 1 ja SYTO 60 jodiidi vaatlused haavades, mis olid nakatatud Pseudomonas aeruginosa biokiledega (joonis 4A-D) ja Staphylococcus aureus (joonis 4i-l) (joonis 4i-l), näitas, et pärast 3-päevast töötlemist oli EPS biokile oluliselt vähenenud. Sisaldab hapnikuga varustatud soolasid Ag ja Ag1 + + EDTA/BC. AG1+ kastmed ilma täiendavate antibiofilmi komponentideta vähendasid Pseudomonas aeruginosaga nakatatud haavades oluliselt rakuvaba DNA-d, kuid olid Staphylococcus aureusega inokuleeritud haavades vähem efektiivsed.
Haava biokile in vivo pildistamine pärast 3 -päevast töötlemist kontroll- või hõbedastega. Pseudomonas aeruginosa (A - D) ja Staphylococcus aureus (I - L) konfokaalsed pildid, mis on värvitud TOTO 1 (rohelise) abil, et visualiseerida rakuvälised nukleiinhapped, mis on rakuväliste biofilmi polümeeride komponent. Rakusiseste nukleiinhapete värvimiseks kasutage SYTO 60 (punane). happed. P. Pseudomonas aeruginosa (E - H) ja Staphylococcus aureus (M - P) biokiledega nakatunud haavade skaneeriv elektronmikroskoopia pärast 3 -päevast töötlemist kontroll- ja hõbedaste kastmistega. SEM skaala riba = 5 µm. Konfokaalse kujutise skaala riba = 50 um.
Skaneeriv elektronmikroskoopia näitasid, et hiired, kes olid nakatatud Pseudomonas aeruginosa (joonis 4E-H) ja Staphylococcus aureus (joonis 4M-P) biokile kolooniatega, oli pärast 3-päevast töötlust kõigi hõbedaste kastmete korral oluliselt vähem baktereid.
Hõbedaste kastmete mõju hindamiseks haavapõletikule biokilega nakatunud hiirtel olid 3 päeva jooksul kontrollitud biokilega nakatunud haavade lõigud immunohistokeemiliselt värvitud, kasutades neutrofiilide ja makrofaagide jaoks spetsiifilisi antikehi. Neutrofiilide ja makrofaagide kvantitatiivne määramine sisemiselt. Granuleerimiskude. Joonis 5). Kõik hõbedased kastmed vähendasid Pseudomonas aeruginosaga nakatunud haavade neutrofiilide ja makrofaagide arvu võrreldes pärast kolmepäevast ravi mitte antimikroobsete kontrollikatetega. Ravi hapnikuga rikastatud hõbesasoola kastmega vähendas neutrofiilide (p = <0,0001) ja makrofaagide (p = <0,0001) suuremat vähenemist võrreldes teiste testitud hõbedaste riietega (joonis 5I, J). Ehkki AG1++ EDTA/BC mõjutas haava biokilet suurem mõju, vähendas see vähemal määral neutrofiilide ja makrofaagide taset kui Ag1+ kaste. Pärast Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) ja Ag1 ++ EDTA/BC (p = 0,0043) oksisoolidega (P = 0,0043) oksisoolidega nakatusid S. aureuse biokilega nakatunud mõõdukad haavad. Sarnaseid suundumusi täheldatakse neutropeenia puhul. sideme (joonis 5K). Kuid ainult hapnikuga varustatud Ag -soolakaste näitas makrofaagide arvu olulist vähenemist granuleerimiskoes, võrreldes S. aureuse biokiledega nakatunud haavade kontrolliga (P = 0,0339) (joonis 5L).
Neutrofiilid ja makrofaagid kvantifitseeriti Pseudomonas aeruginosa ja Staphylococcus aureus biokiledega nakatunud haavades pärast 3-päevast töötlemist mitte-antimikroobse kontrolli või hõbedastega. Neutrofiilid (AD) ja makrofaagid (EH) kvantifitseeriti koe lõikudes, mis olid värvitud neutrofiilide või makrofaagide jaoks spetsiifiliste antikehadega. Neutrofiilide (I ja K) ja makrofaagide (J ja L) kvantifitseerimine Pseudomonas aeruginosa (I ja J) ja Staphylococcus aureus (K&L) biokiledega nakatunud haavades. N = 12 rühma kohta. Graafikud näitavad keskmist +/- standardviga, olulisuse väärtusi võrreldes mitte-antibakteriaalse juhtimiskastmega, * tähendab p = <0,05, ** tähendab p = <0,01; *** tähendab p = <0,001; tähistab p = <0,0001).
Seejärel hindasime hõbedaste kaste mõju nakkusest sõltumatule paranemisele. Nakatumata ekstsisioonihaavu töödeldi 3 päeva jooksul mitte-antimikroobse kontrollikastme või hõbedase kastmega (joonis 6). Testitud hõbedaste kastmete hulgas näisid makroskoopilistel piltidel väiksemad hapnikuga varustatud soolakastmega töödeldud haavad kui kontrolliga töödeldud haavad (joonis 6A-D). Haavapindala kvantifitseerimine histoloogilise analüüsi abil näitas, et keskmine haavapind pärast töötlemist Ag oksüsooliesindaga oli 2,35 mm2, võrreldes kontrollrühmaga töödeldud haavade 2,96 mm2 -ga, kuid see erinevus ei saavutanud statistilist olulisust (P = 0,488) (joonis) 6i). Seevastu pärast AG1+ (3,38 mm2, p = 0,757) või AG1++ EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) katteid võrreldes kontrollrühmaga võrreldes ei täheldatud haavapindala vähenemist. Suurenenud epiteeli regenereerimist täheldati Ag oksüsoolide kastmega võrreldes kontrollrühmaga (vastavalt 30% vs 22%), ehkki see ei saavutanud olulisust (p = 0,067), see on üsna oluline ja kinnitab varasemaid tulemusi. Oksüsoolidega riietumine soodustab uuesti epiteelimist. -nakatumata haavade epitreseliseerimine17. Seevastu ravi AG1+ või AG1++ EDTA/BC kastetega ei olnud mõju või näitas kontrolliga võrreldes vähenenud uuesti epiteeli.
Hõbehaavade kaste mõju haavade paranemisele nakatumata hiirtel koos täieliku resektsiooniga. (AD) Haavade esindavad makroskoopilised pildid pärast kolmepäevast töötlemist mitte-antimikroobse kontrollikastme ja hõbedase kastmega. (EH) Hematoksüliini ja eosiiniga värvitud tüüpilised haavasektsioonid. Haavapindala (I) kvantifitseerimine ja repitelialiseerimise protsent (J) arvutati haava keskpunktist histoloogilistest sektsioonidest, kasutades pildianalüüsi tarkvara (n = 11–12 ravirühma kohta). Graafikud näitavad keskmist +/- standardviga. * tähendab p = <0,05.
Hõbeda on pikka aega kasutatud antimikroobse raviga haavade paranemisel, kuid paljud erinevad koostised ja kohaletoimetamismeetodid võivad põhjustada erinevusi antimikroobse efektiivsuse osas 18. Veelgi enam, spetsiifiliste hõbedate manustamissüsteemide antibiofilmi omadused ei ole täielikult mõistetavad. Ehkki peremeesorganismi immuunvastus on planktoniliste bakterite suhtes suhteliselt efektiivne, on see biokilede vastu üldiselt vähem efektiivne19. Planktonilised bakterid on makrofaagide abil hõlpsasti fagotsütoositud, kuid biokiledes tekitavad agregeeritud rakud täiendavaid probleeme, piirates peremeesorganismi reageerimist sellele, kui immuunrakud võivad läbida apoptoosi ja vabastada põletikuvastaseid tegureid immuunvastuse tugevdamiseks20. On täheldatud, et mõned leukotsüüdid võivad tungida biokiled21, kuid ei suuda fagotsütose baktereid, kui see kaitse on ohustatud22. Tuleks kasutada terviklikku lähenemisviisi, et toetada peremeesorganismi immuunvastust haava biokile nakkuse vastu. Haavade vaieldamine võib biokile füüsiliselt häirida ja suurema osa bioburdenist eemaldada, kuid peremeesorganismi immuunvastus võib olla ebaefektiivne allesjäänud biokile suhtes, eriti kui peremeesorganismi immuunvastus on ohustatud. Seega saavad antimikroobsed ravimeetodid, näiteks hõbedased sidemed, toetada peremeesorganismi immuunvastust ja kõrvaldada biokilenakkusi. Kompositsioon, kontsentratsioon, lahustuvus ja manustamissubstraat võivad mõjutada hõbeda antimikroobset efektiivsust. Viimastel aastatel on hõbedate töötlemistehnoloogia edusammud muutnud need riided tõhusamaks9,23. Hõbedaste kastetehnoloogia edenedes on oluline mõista nende kaste tõhusust haavainfektsiooni juhtimisel ja mis veelgi olulisem - nende tugeva hõbedate mõjude mõju haavakeskkonnale ja tervenemisele.
Selles uuringus võrdlesime kahe täiustatud hõbedase kaste efektiivsust tavaliste hõbedaste kastmete abil, mis toodavad AG1+ ioone biokilede vastu, kasutades erinevaid in vitro ja in vivo mudeleid. Hinnati ka nende kaste mõju haavakeskkonnale ja infektsioonist sõltumatule paranemisele. Tarnimismaatriksi mõju minimeerimiseks koosnesid kõik testitud hõbedased kastmed karboksümetüültulloosist.
Meie esialgne hinnang nende hõbedaste kastmete kohta Pseudomonas aeruginosa ja Staphylococcus aureus koloonia biokilede vastu näitab, et erinevalt traditsioonilistest AG1+ kastmistest on kahest täiustatud hõbedast riidest, AG1++ EDTA/BC ja hapnikuga varustatud Ag -soolad. Mõni päev. Lisaks takistavad need kasted biokile taaskäivitamist korduva kokkupuute korral planktoniliste bakteritega. AG1+ kaste sisaldas hõbedakloriidi, sama hõbedast ühendit ja alusmaatriksit nagu Ag1++ EDTA/BC ning sellel oli bakterite elujõulisus biokiles samal perioodil piiratud. Vaatlus, et AG1++ EDTA/BC -kaste oli biokile vastu tõhusam kui sama maatriksist ja hõbeühendist koosnev Ag1+ kaste, toetab arusaama, et hõbekloriidi tõhususe suurendamiseks biokile vastu on vaja täiendavaid koostisosi, nagu on teatatud, nagu on teatatud mujal15. Need tulemused toetavad ideed, et BC ja EDTA mängivad täiendavat rolli, mis aitab kaasa riietumise üldisele tõhususele ja et selle komponendi puudumine AG1+ kastetes võis aidata kaasa suutmatusele näidata in vitro tõhusust. Leidsime, et AG2+ ja AG3+ ioonide toota hapnikuga varustatud Ag -soolasidemed olid tugevamad antibakteriaalne efektiivsus kui AG1+ ja tasemel, mis sarnaneb AG1++ EDTA/BC -ga. Siiski on kõrge redokspotentsiaali tõttu ebaselge, kui kaua AG3+ ioonid püsivad aktiivseks ja efektiivseks haava biokilede vastu ning väärib seetõttu edasist uurimist. Lisaks on palju erinevaid kaste, mis tekitavad AG1+ ioone, mida selles uuringus ei testitud. Need sidemed koosnevad erinevatest hõbeühenditest, kontsentratsioonidest ja alusmaatriksitest, mis võivad mõjutada AG1+ ioonide kohaletoimetamist ja nende tõhusust biokilede vastu. Samuti väärib märkimist, et haavasidemete tõhususe hindamiseks biokilede vastu on palju erinevaid in vitro ja in vivo mudeleid. Kasutatud mudeli tüüp, samuti nendes mudelites kasutatud söötme soola ja proteiinisisaldust mõjutavad kastme tõhusust. Oma in vivo mudelis lasime biokile küpseda in vitro ja viisime selle siis haava nahapinnale. Peremeeshiire immuunvastus on suhteliselt efektiivne haavale rakendatud planktoniliste bakterite suhtes, moodustades sellega haava paranemisel biokile. Küpse biokile lisamine haavale piirab peremeesorganismi immuunvastuse efektiivsust biokile moodustumisele, võimaldades küpsel biofilmil end enne paranemist alustada haava sisse. Seega võimaldab meie mudel meil enne haavade paranemist hinnata antimikroobsete kastmete tõhusust küpsetel biokiledel.
Samuti leidsime, et kaste sobivat mõjutas hõbedaste kastmete tõhusust in vitro kasvatatud biokilede ja seanahaga. Lähedast kontakti haavaga peetakse kriitiliseks riietuse antimikroobse efektiivsuse osas24,25. Hapnikuga varustatud Ag -soola sisaldavad katted olid tihedas kontaktis küpsete biokiledega, mille tulemuseks oli 24 tunni pärast elujõuliste bakterite arvu olulist vähenemist. Seevastu AG1+ ja AG1++ EDTA/BC -kattega töödeldud oli seevastu märkimisväärne arv elujõulisi baktereid. Need katted sisaldavad õmblusi kogu kastme pikkuses, mis loob surnud ruumid, mis takistavad tihedat kontakti biokilega. Meie in vitro uuringutes takistasid need kontaktivabad piirkonnad biokile elujõuliste bakterite tapmist. Hindasime bakterite elujõulisust alles pärast 24 -tunnist ravi; Aja jooksul, kui kaste muutub küllastunud, võib nende elujõuliste bakterite pindala vähendada vähem surnud ruumi. Kuid see rõhutab kastme koostise tähtsust, mitte ainult hõbedatüüpi kastet.
Kuigi in vitro uuringud on kasulikud erinevate hõbetehnoloogiate tõhususe võrdlemiseks, on oluline mõista ka nende kaste mõju in vivo biokiledele, kus peremeede kude ja immuunvastus aitab kaasa biokilede vastu suunatud kaste efektiivsusele. Nende kaste mõju haava biokiledele täheldati skaneeriva elektronmikroskoopia ja biokile EPS -i värvimise abil, kasutades rakusiseseid ja rakuväliseid DNA värvaineid. Leidsime, et pärast 3-päevast töötlemist olid kõik sidemed tõhusad biokilega nakatunud haavade rakuvaba DNA vähendamisel, kuid AG1+ kaste oli Staphylococcus aureus-nakatunud haavades vähem efektiivne. Skaneeriv elektronmikroskoopia näitas ka seda, et hõbedaste kastmistega töödeldud haavades oli oluliselt vähem baktereid, ehkki see oli rohkem väljendunud hapnikuga varustatud Ag soolakastme ja AG1++ EDTA/BC kastmega võrreldes AG1+ -ga. Need andmed näitavad, et testitud hõbedastel kastmistel oli biokile struktuurile erinev mõju, kuid ükski hõbedane kaste ei suutnud biokile likvideerida, toetades vajadust tervikliku lähenemisviisi järele haavade biokile nakkuste raviks; Hõbedate käepaelte kasutamine. Ravile eelneb suurem osa biokile eemaldamiseks füüsilisest vahutamisest.
Kroonilised haavad on sageli tugevas põletikus, kusjuures liigsed põletikulised rakud jäävad haavakoesse pikema aja jooksul, põhjustades kudede kahjustusi ja kahandades raku efektiivseks metabolismi ja funktsiooni haagis26 -s vajalikku hapnikku. Biokiled süvendavad seda vaenulikku haavakeskkonda, mõjutades negatiivselt paranemist mitmel viisil, sealhulgas rakkude proliferatsiooni ja migratsiooni ja proinflammatoorsete tsütokiinide aktiveerimise pärssimisega27. Kuna hõbedased sidemed muutuvad tõhusamaks, on oluline mõista nende mõju haavakeskkonnale ja tervenemisele.
Huvitav on see, et kuigi kõik hõbedased kastmed mõjutasid biokile koostist, suurendasid nende nakatunud haavade uuesti epiteelialiseerimist ainult hapnikuga varustatud hõbeda soolaga. Need andmed toetavad meie varasemaid leide17 ja Kalan et al. (2017) 28, mis näitasid hapnikuga rikastatud hõbedaste soolade head ohutus- ja toksilisuse profiile, kuna madalamad hõbeda kontsentratsioonid olid efektiivsed biokilede vastu.
Meie praegune uuring rõhutab hõbetehnoloogia erinevusi antimikroobsete hõbedaste kastmete ning selle tehnoloogia mõju vahel haavakeskkonnale ja infektsioonist sõltumatule paranemisele. Kuid need tulemused erinevad varasematest uuringutest, mis näitavad, et Ag1 + + EDTA/BC riietus parandas in vivo vigastatud küülikute kõrvade paranemisparameetreid. Selle põhjuseks võib siiski olla erinevused loommudelites, mõõtmisajad ja bakterite kasutamise meetodid29. Sel juhul tehti haavade mõõtmised 12 päeva pärast vigastust, et kaste toimeained saaksid biokile pikema aja jooksul toimida. Seda toetab uuring, mis näitas, et AG1 + + + EDTA/BC -ga ravitud kliiniliselt nakatunud jalgade haavandid suurenesid algselt pärast ühe nädal ravi ja seejärel järgmise 3 nädala jooksul AG1 + + EDTA/BC -ga ravi ja 4 nädala jooksul pärast 4 nädalat pärast 4 nädalat. Mitte antimikroobsete kasutamine. ravimid. CMC -katted haavandite suuruse vähendamiseks30.
Teatud hõbeda vormid ja kontsentratsioonid on varem osutunud tsütotoksiliseks in vitro 11, kuid need in vitro tulemused ei tähenda alati in vivo kahjulikku mõju. Lisaks on paljude ohutute ja tõhusate hõbedaste kastmete väljatöötamiseni hõbedatehnoloogia edusammud ning hõbedaste ühendite ja kontsentratsioonide parem mõistmine. Hõbedaste tehnoloogia arenedes on aga oluline mõista nende kaste mõju haavakeskkonnale31,32,33. Varem teatati, et suurenenud uuestipitelialiseerumise määr vastab põletikuvastaste M2 makrofaagide suurenenud osakaalule võrreldes põletikuvastase M1 fenotüübiga. Seda täheldati eelmises hiiremudelis, kus võrreldi hõbedast hüdrogeeli haavasidemeid hõbedasulfadiasiini ja mitte-antimikroobsete hüdroges34-ga.
Kroonilised haavad võivad ilmneda liigset põletikku ja on täheldatud, et liigsete neutrofiilide esinemine võib olla kahjulik haavade paranemisele35. Neutrofiilide vaesestatud hiirte uuringus lükkas neutrofiilide esinemine repiteelialiseerumist. Liigsete neutrofiilide esinemine põhjustab kõrgeid proteaase ja reaktiivseid hapnikuliike, näiteks superoksiid ja vesinikperoksiid, mis on seotud krooniliste ja aeglaselt tervendavate haavadega37,38. Samuti võib makrofaagide arvu suurenemine kontrollimata põhjustada haavade hilinemist39. See kasv on eriti oluline, kui makrofaagid ei suuda üleminekut põletikulisest fenotüübist soodustavale fenotüübile, mille tagajärjel haavad ei pääse tervenemise põletikulisest faasist40. Pärast 3-päevast töötlemist kõigi hõbedaste kastetega täheldasime biokilega nakatunud haavade neutrofiilide ja makrofaagide langust, kuid vähenemine oli rohkem väljendunud hapnikuga varustatud soolakattega. See langus võib olla immuunvastuse otsene tulemus hõbedale, reageerimine vähenenud bioburdenile või haav on paranemise hilisemas etapis ja seetõttu haava immuunrakkude vähenemine. Põletikurakkude arvu vähendamine haavas võib säilitada haavade paranemist soodustava keskkonna. AG-oksüsaltide nakkusest sõltumatu paranemise soodustamise toimemehhanism on ebaselge, kuid ag-oksüsaltide võime hapnikku toota ja hävitada põletiku vahendaja vesinikperoksiidi kahjulik tase võib seda selgitada ja nõuab täiendavaid uuringuid17.
Kroonilised mitte-paranemisega nakatunud haavad kujutavad endast probleemi nii arstidele kui ka patsientidele. Ehkki paljud kastmed väidavad antimikroobset tõhusust, keskenduvad uuringud harva muudele haava mikrokeskkonda mõjutavatele peamistele teguritele. See uuring näitab, et erinevatel hõbetehnoloogiatel on erinev antimikroobne efektiivsus ja, mis kõige tähtsam, erinev mõju haavakeskkonnale ja paranemisele, sõltumata nakkusest. Kuigi need in vitro ja in vivo uuringud näitavad nende kaste tõhusust haavainfektsioonide ravis ja paranemise soodustamisel, on nende kaste tõhususe hindamiseks kliinikus vaja randomiseeritud kontrollitud uuringuid.
Käesoleva uuringu käigus kasutatud ja/või analüüsitud andmekogumid on vastava autori jaoks mõistliku päringu alusel saadaval.
Postiaeg: 15. juuli-20124