Täname teid nature.com külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame kasutada brauseri uusimat versiooni (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim). Lisaks on see sait jätkuva toe tagamiseks stiilidest ja JavaScriptist vaba.
Skeletilihas on heterogeenne kude, mis koosneb peamiselt müofibrillidest, mida inimestel liigitatakse tavaliselt kolme tüüpi: üks „aeglane“ (tüüp 1) ja kaks „kiire“ (tüübid 2A ja 2X). Heterogeensus traditsiooniliste müofibrillitüüpide vahel ja sees on aga endiselt halvasti mõistetav. Rakendasime transkriptoomilist ja proteoomilist lähenemisviisi vastavalt 1050 ja 1038 individuaalsele müofibrillile inimese vastus lateralis'est. Proteoomilises uuringus osalesid mehed ning transkriptoomilises uuringus 10 meest ja 2 naist. Lisaks müosiini raske ahela isovormidele tuvastasime mitmemõõtmelise müofibrillidevahelise varieeruvuse allikatena metaboolsed valgud, ribosomaalsed valgud ja rakulised ühendusvalgud. Lisaks, hoolimata aeglaste ja kiirete kiudude klastrite tuvastamisest, näitavad meie andmed, et 2X tüüpi kiud on fenotüübiliselt eristamatud teistest kiirelt tõmblevatest kiududest. Lisaks ei ole müosiini raske ahela põhinev klassifikatsioon piisav, et kirjeldada müofibrilli fenotüüpi nemaliinsete müopaatiate korral. Üldiselt viitavad meie andmed müofibri mitmemõõtmelisele heterogeensusele, mille variatsiooniallikad ulatuvad müosiini raske ahela isovormidest kaugemale.
Rakkude heterogeensus on kõigi bioloogiliste süsteemide loomupärane omadus, mis võimaldab rakkudel spetsialiseeruda kudede ja rakkude erinevate vajaduste rahuldamiseks.1 Traditsiooniline arusaam skeletilihaskiudude heterogeensusest on olnud, et motoorsed neuronid määravad motoorse üksuse kiutüübi ja et kiutüüp (st inimestel tüüp 1, tüüp 2A ja tüüp 2X) määratakse müosiini raske ahela (MYH) isovormide omaduste järgi.2 Algselt põhines see nende pH ATPaasi ebastabiilsusel,3,4 ja hiljem MYH molekulaarsel ekspressioonil.5 Kuid mitme MYH-i erinevates proportsioonides ekspresseerivate „segatud” kiudude tuvastamise ja hilisema aktsepteerimisega vaadeldakse skeletilihaskiude üha enam pigem kontiinumina kui eraldi kiutüüpidena.6 Vaatamata sellele tugineb see valdkond endiselt suuresti MYH-le kui müokiudude klassifitseerimise peamisele klassifikaatorile, mis on tõenäoliselt mõjutatud varajaste näriliste uuringute piirangutest ja olulistest eelarvamustest, mille MYH ekspressiooniprofiilid ja kiutüüpide valik erinevad inimeste omadest.2 Olukorda teeb veelgi keerulisemaks asjaolu, et erinevatel inimese skeletilihastel on mitmekesine kiutüüpide valik.7 Vastus lateralis on segatud lihas vahepealse (ja seega representatiivse) MYH ekspressiooniprofiiliga.7 Lisaks teeb selle proovivõtmise lihtsus sellest inimestel kõige paremini uuritud lihase.
Seega on skeletilihaskiudude mitmekesisuse erapooletu uurimine võimsate „oomika“ vahenditega kriitilise tähtsusega, kuid ka keeruline, osaliselt skeletilihaskiudude mitmetuumalise olemuse tõttu. Transkriptoomika8,9 ja proteoomika10 tehnoloogiad on aga viimastel aastatel tänu mitmesugustele tehnoloogilistele edusammudele tundlikkuses läbi teinud revolutsiooni, võimaldades skeletilihaseid analüüsida ühekiulise resolutsiooniga. Selle tulemusena on tehtud märkimisväärseid edusamme ühekiulise mitmekesisuse ja nende reaktsiooni iseloomustamisel atroofilistele stiimulitele ja vananemisele11,12,13,14,15,16,17,18. Oluline on see, et neil tehnoloogilistel edusammudel on kliinilised rakendused, mis võimaldavad haigusega seotud düsregulatsiooni üksikasjalikumat ja täpsemat iseloomustamist. Näiteks on nemaliini müopaatia, ühe levinuma päriliku lihashaiguse (MIM 605355 ja MIM 161800), patofüsioloogia keeruline ja segane.19,20 Seetõttu võiks skeletilihaskiudude düsregulatsiooni parem iseloomustamine viia oluliste edusammudeni selle haiguse mõistmisel.
Töötasime välja meetodid inimese biopsiaproovidest käsitsi eraldatud üksikute skeletilihaskiudude transkriptoomiliseks ja proteoomiliseks analüüsiks ning rakendasime neid tuhandete kiudude puhul, mis võimaldas meil uurida inimese skeletilihaskiudude rakulist heterogeensust. Selle töö käigus demonstreerisime lihaskiudude transkriptoomilise ja proteoomilise fenotüüpimise võimsust ning tuvastasime metaboolsed, ribosomaalsed ja rakulised ühendusvalgud kui kiududevahelise varieeruvuse olulised allikad. Lisaks iseloomustasime seda proteoomilist töövoogu kasutades nematoodide müopaatia kliinilist olulisust üksikute skeletilihaskiudude puhul, näidates MYH-l põhinevat koordineeritud nihet mitteoksüdatiivsete kiudude suunas, sõltumatult kiutüübist.
Inimese skeletilihaskiudude heterogeensuse uurimiseks töötasime välja kaks töövoogu, mis võimaldavad üksikute skeletilihaskiudude transkriptoomi ja proteoomi analüüsi (joonis 1A ja lisajoonis 1A). Töötasime välja ja optimeerisime mitu metodoloogilist sammu, alates proovi säilitamisest ja RNA ning valgu terviklikkuse säilitamisest kuni iga lähenemisviisi läbilaskevõime optimeerimiseni. Transkriptoomi analüüsi puhul saavutati see proovispetsiifiliste molekulaarsete vöötkoodide sisestamisega pöördtranskriptsiooni algfaasis, mis võimaldas koondada 96 kiudu tõhusaks edasiseks töötlemiseks. Sügavam sekveneerimine (±1 miljon lugemist kiu kohta) võrreldes traditsiooniliste üherakuliste meetoditega rikastas transkriptoomi andmeid veelgi.21 Proteoomika jaoks kasutasime lühikest kromatograafilist gradienti (21 minutit) koos DIA-PASEF andmete kogumisega timsTOF massispektromeetril, et optimeerida proteoomi sügavust, säilitades samal ajal kõrge läbilaskevõime.22,23 Tervete skeletilihaskiudude heterogeensuse uurimiseks iseloomustasime 14 terve täiskasvanud doonori 1050 üksiku kiu transkriptoome ja 5 terve täiskasvanud doonori 1038 kiu proteoome (lisatabel 1). Selles artiklis nimetatakse neid andmekogumeid vastavalt 1000-kiulisteks transkriptoomideks ja proteoomideks. Meie lähenemisviis tuvastas 1000-kiulise transkriptoomilise ja proteoomilise analüüsi käigus kokku 27 237 transkripti ja 2983 valku (joonis 1A, lisaandmekogumid 1–2). Pärast transkriptoomiliste ja proteoomiliste andmekogumite filtreerimist >1000 tuvastatud geeni ja 50% kehtivate väärtuste leidmiseks kiu kohta viidi läbi järgnevad bioinformaatilised analüüsid vastavalt 925 ja 974 kiu jaoks transkriptoomis ja proteoomis. Pärast filtreerimist tuvastati keskmiselt 4257 ± 1557 geeni ja 2015 ± 234 valku (keskmine ± standardhälve) kiu kohta, piiratud indiviididevahelise varieeruvusega (lisajoonised 1B–C, lisaandmekogumid 3–4). Siiski oli osalejate vahel subjektisisene varieeruvus suurem, tõenäoliselt tingitud RNA/valgu saagise erinevustest erineva pikkuse ja ristlõikepindalaga kiudude vahel. Enamiku valkude (>2000) puhul oli variatsioonikordaja alla 20% (lisajoonis 1D). Mõlemad meetodid võimaldasid jäädvustada laia dünaamilist valikut transkripte ja valke, millel on lihaste kokkutõmbumiseks olulised kõrge ekspressiooniga signatuurid (nt ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (lisajoonised 1E–F). Enamik tuvastatud tunnuseid olid transkriptoomilistes ja proteoomilistes andmekogumites ühised (lisajoonis 1G) ning nende tunnuste keskmised UMI/LFQ intensiivsused olid mõistlikult hästi korrelatsioonis (r = 0,52) (lisajoonis 1H).
Transkriptoomika ja proteoomika töövoog (loodud BioRender.com abil). BD Dünaamilise ulatuse kõverad MYH7, MYH2 ja MYH1 jaoks ning arvutatud läviväärtused kiutüübi määramiseks. E, F MYH ekspressiooni jaotus kiudude vahel transkriptoomika ja proteoomika andmekogumites. G, H Ühtlase mitmekesisuse lähenduse ja projektsiooni (UMAP) diagrammid transkriptoomika ja proteoomika jaoks, mis on värvitud MYH-põhise kiutüübi järgi. I, J Tunnusdiagrammid, mis näitavad MYH7, MYH2 ja MYH1 ekspressiooni transkriptoomika ja proteoomika andmekogumites.
Algselt seadsime eesmärgiks määrata igale kiule MYH-põhine kiutüüp, kasutades optimeeritud lähenemisviisi, mis kasutab ära MYH ekspressiooni suurt tundlikkust ja dünaamilist ulatust omika andmekogumites. Varasemates uuringutes on kasutatud suvalisi läviväärtusi, et märgistada kiude puhtaks tüübiks 1, tüübiks 2A, tüübiks 2X või segatüüpi, tuginedes erinevate MYH-de fikseeritud ekspressiooniprotsendile11,14,24. Meie kasutasime teistsugust lähenemisviisi, kus iga kiu ekspressioon järjestati kiudude tüübimiseks kasutatud MYH-de järgi: MYH7, MYH2 ja MYH1, mis vastavad vastavalt tüübile 1, tüübile 2A ja tüübile 2X. Seejärel arvutasime matemaatiliselt iga saadud kõvera alumise käänupunkti ja kasutasime seda lävendina, et määrata kiud iga MYH jaoks positiivseks (läve kohal) või negatiivseks (läve all) (joonis 1B–D). Need andmed näitavad, et MYH7-l (joonis 1B) ja MYH2-l (joonis 1C) on RNA tasandil selgemad sisse/välja ekspressiooniprofiilid võrreldes valgu tasemega. Tõepoolest, valgu tasandil ei ekspresseerinud väga vähesed kiud MYH7 ja ühelgi kiul ei olnud 100% MYH2 ekspressiooni. Järgmisena kasutasime ettemääratud ekspressioonilävesid, et määrata igas andmestikus kõigile kiududele MYH-põhised kiutüübid. Näiteks MYH7+/MYH2-/MYH1- kiud määrati 1. tüüpi, samas kui MYH7-/MYH2+/MYH1+ kiud määrati segatüüpi 2A/2X (täieliku kirjelduse leiate lisatabelist 2). Kõiki kiude koondades täheldasime MYH-põhiste kiutüüpide märkimisväärselt sarnast jaotust nii RNA (joonis 1E) kui ka valgu (joonis 1F) tasemel, samas kui MYH-põhiste kiutüüpide suhteline koostis varieerus indiviidide lõikes ootuspäraselt (lisajoonis 2A). Enamik kiude klassifitseeriti kas puhtaks 1. tüübiks (34–35%) või 2A tüübiks (36–38%), kuigi tuvastati ka märkimisväärne arv segatüüpi 2A/2X kiude (16–19%). Silmatorkav erinevus on see, et puhtaid 2X-tüüpi kiude oli võimalik tuvastada ainult RNA tasemel, kuid mitte valgu tasemel, mis viitab sellele, et MYH kiire ekspressioon on vähemalt osaliselt reguleeritud transkriptsioonijärgselt.
Valideerisime oma proteoomikal põhinevat MYH kiudude tüpiseerimise meetodit antikehade-põhise dot blot analüüsi abil ja mõlemad meetodid saavutasid 100% vastavuse puhaste 1. ja 2A. tüüpi kiudude tuvastamisel (vt lisajoonis 2B). Proteoomikal põhinev lähenemisviis oli aga tundlikum ja tõhusam segatud kiudude tuvastamisel ning iga kiu iga MYH geeni osakaalu kvantifitseerimisel. Need andmed näitavad objektiivse, ülitundliku oomikal põhineva lähenemisviisi efektiivsust skeletilihaskiudude tüüpide iseloomustamiseks.
Seejärel kasutasime transkriptoomika ja proteoomika abil saadud kombineeritud teavet müokiudude objektiivseks klassifitseerimiseks nende täieliku transkriptoomi või proteoomi põhjal. Kasutades ühtlase mitmekesisuse lähendamise ja projektsiooni (UMAP) meetodit dimensionaalsuse vähendamiseks kuueks põhikomponendiks (lisajoonised 3A–B), suutsime visualiseerida müokiudude varieeruvust transkriptoomis (joonis 1G) ja proteoomis (joonis 1H). Tähelepanuväärne on see, et müokiudude rühmitamist ei toimunud transkriptoomika ega proteoomika andmekogumites osalejate (lisajoonised 3C–D) ega testimispäevade (lisajoonis 3E) järgi, mis viitab sellele, et skeletilihaskiudude subjektisisene varieeruvus on suurem kui subjektidevaheline varieeruvus. UMAP-graafikul tekkisid kaks erinevat klastrit, mis esindavad „kiireid“ ja „aeglasi“ müokiududeid (joonised 1G–H). MYH7+ (aeglased) müofiibrid paiknesid UMAP1 positiivses pooluses, samas kui MYH2+ ja MYH1+ (kiired) müofiibrid paiknesid UMAP1 negatiivses pooluses (joonis 1I–J). Siiski ei tehtud MYH ekspressiooni põhjal vahet kiirelt tõmblevate kiudude tüüpide (st tüüp 2A, tüüp 2X või segatüüpi 2A/2X) vahel, mis viitab sellele, et MYH1 (joonis 1I–J) või teiste klassikaliste 2X müofiibrite markerite, näiteks ACTN3 või MYLK2 (lisajoonis 4A–B) ekspressioon ei erista erinevaid müofiibrite tüüpe, kui arvestada kogu transkriptoomi või proteoomi. Lisaks, võrreldes MYH2 ja MYH7-ga, oli vähe transkripte või valke MYH1-ga positiivses korrelatsioonis (lisajoonis 4C–H), mis viitab sellele, et MYH1 arvukus ei kajasta täielikult müofiibrite transkriptoomi/proteoomi. Sarnastele järeldustele jõuti kolme MYH isovormi segatud ekspressiooni hindamisel UMAP tasemel (lisajoonised 4I–J). Seega, kuigi 2X kiude saab transkripti tasemel tuvastada ainult MYH kvantifitseerimise põhjal, ei ole MYH1+ kiude võimalik teistest kiiretest kiududest eristada, kui arvestada kogu transkriptoomi või proteoomi.
Aeglaste kiudude heterogeensuse esialgse uurimisena peale MYH-i hindasime nelja väljakujunenud aeglase kiu tüübispetsiifilist valku: TPM3, TNNT1, MYL3 ja ATP2A22. Aeglaste kiudude alatüübid näitasid nii transkriptoomikas (lisajoonis 5A) kui ka proteoomikas (lisajoonis 5B) kõrgeid, kuigi mitte täiuslikke Pearsoni korrelatsioone MYH7-ga. Ligikaudu 25% ja 33% aeglastest kiududest ei klassifitseeritud puhaste aeglaste kiududena kõigi geeni/valgu alatüüpide järgi transkriptoomikas (lisajoonis 5C) ja proteoomikas (lisajoonis 5D). Seetõttu toob aeglaste kiudude klassifitseerimine mitme geeni/valgu alatüübi põhjal kaasa täiendava keerukuse isegi valkude puhul, mis on teadaolevalt kiu tüübispetsiifilised. See viitab sellele, et ühe geeni/valgu perekonna isovormidel põhinev kiudude klassifitseerimine ei pruugi skeletilihaskiudude tegelikku heterogeensust adekvaatselt kajastada.
Inimese skeletilihaskiudude fenotüübilise varieeruvuse edasiseks uurimiseks kogu omika mudeli skaalal viisime läbi andmete erapooletu dimensionaalsuse vähendamise, kasutades peakomponentide analüüsi (PCA) (joonis 2A). Sarnaselt UMAP-graafikutega ei mõjutanud ei osaleja ega testimispäev kiudude klasterdumist PCA tasandil (lisajoonised 6A–C). Mõlemas andmekogumis selgitas MYH-põhist kiutüüpi PC2, mis näitas aeglase tõmblemisega 1. tüüpi kiudude klastrit ja teist klastrit, mis sisaldas kiire tõmblemisega 2A-tüüpi, 2X-tüüpi ja segatüüpi 2A/2X-kiude (joonis 2A). Mõlemas andmekogumis olid need kaks klastrit ühendatud väikese arvu segatüüpi 1/2A-kiududega. Nagu oodatud, kinnitas peamiste PC-draiverite üleesindatuse analüüs, et PC2-d juhtisid kontraktiilsed ja metaboolsed signatuurid (joonis 2B ja lisajoonised 6D–E, lisaandmekogumid 5–6). Üldiselt leiti, et MYH-põhine kiutüüp on piisav, et selgitada pidevat variatsiooni piki PC2-d, välja arvatud nn 2X kiud, mis olid kiire klastri transkriptoomi ulatuses jaotunud.
A. Transkriptoomi ja proteoomi andmestike põhikomponentide analüüsi (PCA) graafikud, mis on värvitud vastavalt kiutüübile MYH põhjal. B. Transkripti ja valgu draiverite rikastamisanalüüs PC2-s ja PC1-s. Statistiline analüüs viidi läbi clusterProfiler paketi ja Benjamini-Hochbergi korrigeeritud p-väärtuste abil. C, D. PCA graafikud, mis on värvitud vastavalt transkriptoomi rakkudevahelise adhesiooni geeni ontoloogia (GO) terminitele ja proteoomi kostameeri GO terminitele. Nooled esindavad transkripti ja valgu draivereid ja nende suunda. E, F. Kliiniliselt oluliste tunnuste ühtlase mitmekesisuse lähenduse ja projektsiooni (UMAP) graafikud, mis näitavad ekspressioonigradiente sõltumatult aeglasest/kiire kiutüübist. G, H. PC2 ja PC1 draiverite vahelised korrelatsioonid transkriptoomides ja proteoomides.
Ootamatult selgitas MYH-põhine müofiibertüüp vaid teist kõrgeimat varieeruvuse astet (PC2), mis viitab sellele, et skeletilihaskiudude heterogeensuse reguleerimisel mängivad olulist rolli muud bioloogilised tegurid, mis ei ole seotud MYH-põhise müofiibertüübiga (PC1). PC1 peamiste mõjurite üleesindatuse analüüs näitas, et PC1 varieeruvuse määrasid peamiselt transkriptoomi rakkudevaheline adhesioon ja ribosoomi sisaldus ning proteoomi kostameerid ja ribosoomi valgud (joonis 2B ja lisajoonised 6D–E, lisaandmekogum 7). Skeletilihastes ühendavad kostameerid Z-ketta sarkolemmaga ning osalevad jõuülekandes ja signaaliülekandes. 25 Rakkudevahelise adhesiooni (transkriptoom, joonis 2C) ja kostameeri (proteoom, joonis 2D) tunnuseid kasutades tehtud annoteeritud PCA graafikud näitasid PC1 tugevat vasakule nihkumist, mis näitab, et need tunnused on teatud kiududes rikastatud.
Müokiudude klastrite detailsem uurimine UMAP tasandil näitas, et enamikul tunnustel oli pigem müokiudude tüübist sõltumatu MYH-põhine ekspressioonigradient kui müokiudude alamklastri spetsiifiline. Seda järjepidevust täheldati mitmete patoloogiliste seisunditega seotud geenide puhul (joonis 2E), näiteks CHCHD10 (neuromuskulaarne haigus), SLIT3 (lihaste atroofia), CTDNEP1 (lihaste haigus). Seda järjepidevust täheldati ka kogu proteoomi ulatuses, sealhulgas neuroloogiliste häiretega seotud valkude (UGDH), insuliini signaaliülekande (PHIP) ja transkriptsiooni (HIST1H2AB) puhul (joonis 2F). Kokkuvõttes näitavad need andmed kiudude tüübist sõltumatu aeglase/kiire tõmblemise heterogeensuse järjepidevust erinevate müokiudude vahel.
Huvitaval kombel näitasid PC2 juhtgeenid head transkriptoom-proteoom korrelatsiooni (r = 0,663) (joonis 2G), mis viitab sellele, et aeglase ja kiire kontraktsiooniga kiutüübid ning eriti skeletilihaskiudude kontraktiilsed ja metaboolsed omadused on transkriptsiooniliselt reguleeritud. PC1 juhtgeenid aga transkriptoom-proteoom korrelatsiooni ei näidanud (r = -0,027) (joonis 2H), mis viitab sellele, et aeglase/kiire kontraktsiooniga kiutüüpidega mitteseotud variatsioonid on suures osas reguleeritud posttranskriptsiooniliselt. Kuna PC1 variatsioone selgitati peamiselt ribosomaalsete geenide ontoloogia terminitega ja arvestades, et ribosoomidel on rakus oluline ja spetsialiseerunud roll, osaledes aktiivselt valkude translatsioonis ja seda mõjutades,31 asusime järgmiseks uurima seda ootamatut ribosomaalset heterogeensust.
Esmalt värvisime proteoomika põhikomponentide analüüsi graafiku vastavalt valkude suhtelisele arvukusele GOCC terminis „tsütoplasmaatiline ribosoom” (joonis 3A). Kuigi see termin on PC1 positiivsel poolel rikastatud, mille tulemuseks on väike gradient, juhivad ribosomaalsed valgud PC1 jaotumist mõlemas suunas (joonis 3A). PC1 negatiivsel poolel rikastatud ribosomaalsete valkude hulka kuulusid RPL18, RPS18 ja RPS13 (joonis 3B), samas kui RPL31, RPL35 ja RPL38 (joonis 3C) olid PC1 positiivse poole peamised liikumapanevad jõud. Huvitaval kombel ekspresseeriti RPL38 ja RPS13 skeletilihastes teiste kudedega võrreldes kõrgelt (lisajoonis 7A). Neid PC1 eristavaid ribosomaalseid signatuure transkriptoomis ei täheldatud (lisajoonis 7B), mis viitab transkriptsioonijärgsele regulatsioonile.
A. Põhikomponentide analüüsi (PCA) graafik, mis on värvitud vastavalt tsütoplasmaatilise ribosoomi geeni ontoloogia (GO) terminitele proteoomi ulatuses. Nooled näitavad valgu vahendatud variatsiooni suunda PCA graafikul. Joone pikkus vastab antud valgu põhikomponendi skoorile. B, C. PCA tunnusgraafikud RPS13 ja RPL38 jaoks. D. Tsütoplasmaatiliste ribosoomi valkude järelevalveta hierarhiline klasterdamise analüüs. E. 80S ribosoomi struktuurimudel (PDB: 4V6X), mis toob esile ribosoomi valgud, millel on erinev arvukus skeletilihaskiududes. F. Ribosoomi valgud, millel on erinev stöhhiomeetria ja mis lokaliseeritud mRNA väljumiskanali lähedal.
Ribosoomi heterogeensuse ja spetsialiseerumise kontseptsioone on varem pakutud, mille kohaselt erinevate ribosoomi alampopulatsioonide (ribosoomi heterogeensus) olemasolu võib otseselt mõjutada valkude translatsiooni erinevates kudedes32 ja rakkudes33 spetsiifiliste mRNA transkriptide kogumite34 selektiivse translatsiooni kaudu (ribosoomi spetsialiseerumine). Skeletilihaskiududes koekspresseeruvate ribosoomi valkude alampopulatsioonide tuvastamiseks viisime läbi proteoomis ribosoomi valkude järelevalveta hierarhilise klasteranalüüsi (joonis 3D, lisaandmekogum 8). Nagu oodatud, ei klasterdunud ribosoomi valgud MYH põhjal kiutüübi järgi. Siiski tuvastasime kolm erinevat ribosoomi valkude klastrit; esimene klaster (ribosoomi_klaster_1) on koreguleeritud RPL38-ga ja seega on selle ekspressioon suurenenud positiivse PC1 profiiliga kiududes. Teine klaster (ribosoomi_klaster_2) on koreguleeritud RPS13-ga ja on kõrgenenud negatiivse PC1 profiiliga kiududes. Kolmas klaster (ribosoomi_klaster_3) ei näita skeletilihaskiududes koordineeritud diferentsiaalset ekspressiooni ja seda võib pidada skeletilihaste ribosoomi "tuumiku" valguks. Nii ribosoomi klastrid 1 kui ka 2 sisaldavad ribosoomi valke, millel on varem näidatud olevat alternatiivse translatsiooni reguleerimine (nt RPL10A, RPL38, RPS19 ja RPS25) ja funktsionaalselt arengut mõjutavad (nt RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Kooskõlas PCA tulemustega näitas ka nende ribosoomi valkude heterogeenne esindatus kiudude vahel järjepidevust (lisajoonis 7C).
Ribosoomi heterogeensete ribosomaalsete valkude asukoha visualiseerimiseks kasutasime inimese 80S ribosoomi struktuurimudelit (Protein Data Bank: 4V6X) (joonis 3E). Pärast erinevatesse ribosomaalsetesse klastritesse kuuluvate ribosomaalsete valkude eraldamist ei olnud nende asukohad tihedalt joondatud, mis viitab sellele, et meie lähenemisviis ei suutnud ribosoomi teatud piirkondade/fraktsioonide rikastumist tagada. Huvitaval kombel oli aga suurte subühikute valkude osakaal 2. klastris madalam kui 1. ja 3. klastris (lisajoonis 7D). Täheldasime, et skeletilihaskiududes muutunud stöhhiomeetriaga valgud lokaliseerusid peamiselt ribosoomi pinnale (joonis 3E), mis on kooskõlas nende võimega suhelda ribosoomi sisemiste sisenemiskohtade (IRES) elementidega erinevates mRNA populatsioonides, koordineerides seeläbi selektiivset translatsiooni.40, 41 Lisaks asusid paljud skeletilihaskiududes muutunud stöhhiomeetriaga valgud funktsionaalsete piirkondade, näiteks mRNA väljumistunneli lähedal (joonis 3F), mis reguleerivad selektiivselt spetsiifiliste peptiidide translatsiooni pikenemist ja peatumist. 42 Kokkuvõttes näitavad meie andmed, et skeletilihaste ribosomaalsete valkude stöhhiomeetria on heterogeenne, mille tulemuseks on erinevused skeletilihaskiudude vahel.
Järgmisena asusime tuvastama kiire ja aeglase tõmbega kiudude signatuure ning uurima nende transkriptsioonilise regulatsiooni mehhanisme. Võrreldes UMAP-i abil määratletud kiire ja aeglase tõmbega kiudude klastreid kahes andmekogumis (joonised 1G–H ja 4A–B), tuvastasid transkriptoomilised ja proteoomilised analüüsid vastavalt 1366 ja 804 erinevalt esinevat tunnust (joonised 4A–B, lisaandmekogumid 9–12). Täheldasime oodatavaid erinevusi signatuurides, mis olid seotud sarkomeeride (nt tropomüosiin ja troponiin), ergastus-kontraktsiooni sidestuse (SERCA isovormid) ja energia metabolismiga (nt ALDOA ja CKB). Lisaks ekspresseerusid valkude ubikvitinatsiooni reguleerivad transkriptid ja valgud erinevalt kiire ja aeglase tõmbega kiududes (nt USP54, SH3RF2, USP28 ja USP48) (joonised 4A–B). Lisaks oli mikroobse valgu geen RP11-451G4.2 (DWORF), mille ekspressiooni on varem näidatud erinevalt erineda lambaliha lihaskiudude tüüpide vahel43 ja mis suurendab SERCA aktiivsust südamelihases44, aeglastes skeletilihaskiududes oluliselt ülesreguleeritud (joonis 4A). Samamoodi täheldati individuaalsete kiudude tasandil olulisi erinevusi teadaolevates signatuurides, nagu metabolismiga seotud laktaatdehüdrogenaasi isovormid (LDHA ja LDHB, joonis 4C ja lisajoonis 8A)45,46, samuti varem tundmatutes kiutüübispetsiifilistes signatuurides (nagu IRX3, USP54, USP28 ja DPYSL3) (joonis 4C). Transkriptoomiliste ja proteoomiliste andmekogumite vahel esines märkimisväärne diferentsiaalselt ekspresseeritud tunnuste kattumine (lisajoonis 8B), samuti kordsete muutuste korrelatsioon, mida tingis peamiselt sarkomeersete tunnuste väljendunum diferentsiaalne ekspressioon (lisajoonis 8C). Märkimisväärselt näitasid mõned signatuurid (nt USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) tugevat transkriptsioonijärgset regulatsiooni ainult proteoomilisel tasandil ja neil olid aeglase/kiire tõmblemisega kiudude tüübispetsiifilised ekspressiooniprofiilid (lisajoonis 8C).
A ja B vulkaanidiagrammid, mis võrdlevad joonistel 1G–H ühtlase mitmekesisuse lähenduse ja projektsiooni (UMAP) graafikute abil tuvastatud aeglaseid ja kiireid klastreid. Värvilised täpid tähistavad transkripte või valke, mis erinevad oluliselt FDR < 0,05 juures, ja tumedamad täpid tähistavad transkripte või valke, mis erinevad oluliselt logaritmilise muutuse > 1 juures. Kahesuunaline statistiline analüüs viidi läbi, kasutades DESeq2 Waldi testi Benjamini-Hochbergi korrigeeritud p-väärtustega (transkriptoomika) või Limma lineaarse mudeli meetodit empiirilise Bayesi analüüsiga, millele järgnes Benjamini-Hochbergi korrigeerimine mitmekordseks võrdluseks (proteoomika). C Valitud diferentsiaalselt ekspresseeritud geenide või valkude signatuurdiagrammid aeglaste ja kiirete kiudude vahel. D Oluliselt diferentsiaalselt ekspresseeritud transkriptide ja valkude rikastamisanalüüs. Kattuvad väärtused on rikastatud mõlemas andmekogumis, transkriptoomi väärtused on rikastatud ainult transkriptoomis ja proteoomi väärtused on rikastatud ainult proteoomis. Statistiline analüüs viidi läbi clusterProfiler paketi abil Benjamini-Hochbergi korrigeeritud p-väärtustega. E. SCENICi abil tuvastatud kiutüübispetsiifilised transkriptsioonifaktorid, mis põhinevad SCENICist tuletatud regulaatorite spetsiifilisuse skooridel ja mRNA erineval ekspressioonil kiutüüpide vahel. F. Aeglaste ja kiirete kiudude vahel erinevalt ekspresseeritud valitud transkriptsioonifaktorite profiilid.
Seejärel viisime läbi diferentseeritult esindatud geenide ja valkude üleesindatuse analüüsi (joonis 4D, lisaandmekogum 13). Kahe andmekogumi vahel erinevate tunnuste puhul rikastatud radade arv näitas oodatavaid erinevusi, näiteks rasvhapete β-oksüdatsioon ja ketooni metabolismi protsessid (aeglased kiud), müofilamentide/lihaste kokkutõmbumine (vastavalt kiired ja aeglased kiud) ning süsivesikute kataboolsed protsessid (kiired kiud). Seriini/treoniini valgu fosfataasi aktiivsus oli samuti kiiretes kiududes suurenenud, mida ajendasid sellised tunnused nagu regulatiivsed ja katalüütilised fosfataasi subühikud (PPP3CB, PPP1R3D ja PPP1R3A), mis teadaolevalt reguleerivad glükogeeni metabolismi (47) (lisajoonised 8D–E). Teiste kiiretes kiududes rikastatud radade hulka kuulusid töötlemiskehad (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) proteoomis (lisajoonis 8F), mis võivad olla seotud transkriptsioonijärgse regulatsiooniga (48), ja transkriptsioonifaktorite aktiivsus (SREBF1, RXRG, RORA) transkriptoomis (lisajoonis 8G). Aeglased kiud rikastati oksüdoreduktaasi aktiivsusega (BDH1, DCXR, TXN2) (lisajoonis 8H), amiidi sidumisega (CPTP, PFDN2, CRYAB) (lisajoonis 8I), rakuvälise maatriksiga (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (lisajoonis 8J) ja retseptor-ligandi aktiivsusega (FNDC5, SPX, NENF) (lisajoonis 8K).
Aeglaste/kiirete lihaskiudude tüübi omaduste aluseks oleva transkriptsioonilise regulatsiooni paremaks mõistmiseks viisime läbi transkriptsioonifaktorite rikastamise analüüsi, kasutades SCENIC49 (lisaandmekogum 14). Paljud transkriptsioonifaktorid olid kiirete ja aeglaste lihaskiudude vahel märkimisväärselt rikastatud (joonis 4E). See hõlmas transkriptsioonifaktoreid nagu MAFA, mida on varem seostatud kiire lihaskiudude arenguga,50 samuti mitmeid transkriptsioonifaktoreid, mida varem ei olnud seostatud lihaskiudude tüübispetsiifiliste geeniprogrammidega. Nende hulgas olid PITX1, EGR1 ja MYF6 kiiretes lihaskiududes kõige rikastatud transkriptsioonifaktorid (joonis 4E). Seevastu olid ZSCAN30 ja EPAS1 (tuntud ka kui HIF2A) aeglastes lihaskiududes kõige rikastatud transkriptsioonifaktorid (joonis 4E). Sellega kooskõlas ekspresseeriti MAFA-d kõrgemal tasemel UMAP piirkonnas, mis vastab kiiretele lihaskiududele, samas kui EPAS1-l oli vastupidine ekspressioonimuster (joonis 4F).
Lisaks teadaolevatele valke kodeerivatele geenidele on arvukalt mittekodeerivaid RNA biotüüpe, mis võivad olla seotud inimese arengu ja haiguste regulatsiooniga.51, 52 Transkriptoomi andmekogumites on mitmel mittekodeerival RNA-l kiudude tüübi spetsiifilisus (joonis 5A ja täiendav andmestik 15), sealhulgas LINC01405, mis on väga spetsiifiline aeglaste kiudude suhtes ja mille kohta on teatatud, et selle sisaldus mitokondriaalse müopaatiaga patsientide lihastes on vähenenud.53 Seevastu RP11-255P5.3, mis vastab geenile lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)54, omab kiirete kiudude tüübi spetsiifilisust. Nii LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) kui ka RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) omavad skeletilihaste spetsiifilisust (lisajoonised 9A–B) ja neil pole oma 1 Mb genoomses naabruses teadaolevaid kontraktiilseid geene, mis viitab sellele, et neil on spetsiifiline roll kiutüüpide reguleerimisel, mitte naaberkontraktiilsete geenide reguleerimisel. LINC01405 ja RP11-255P5.3 aeglase/kiire kiutüübi spetsiifilised ekspressiooniprofiilid kinnitati RNAskoobi abil (joonised 5B–C).
A. Mittekodeerivad RNA transkriptid on oluliselt reguleeritud aeglastes ja kiiretes lihaskiududes. B. RNAskoobi representatiivsed pildid, mis näitavad vastavalt LINC01405 ja RP11-255P5.3 aeglase ja kiire tõmblemise kiutüübi spetsiifilisust. Skaalariba = 50 μm. C. Müofiibertüübispetsiifilise mittekodeeriva RNA ekspressiooni kvantifitseerimine RNAskoobi abil (n = 3 biopsiat sõltumatutelt isikutelt, võrreldes iga isiku kiireid ja aeglaseid lihaskiude). Statistiline analüüs viidi läbi kahepoolse Studendi t-testi abil. Kastidiagrammid näitavad mediaani ning esimest ja kolmandat kvartiili, kus vurrud osutavad miinimum- ja maksimumväärtustele. D. De novo mikroobse valgu identifitseerimise töövoog (loodud BioRender.com abil). E. Mikroobne valk LINC01405_ORF408:17441:17358 ekspresseerub spetsiifiliselt aeglastes skeletilihaskiududes (n = 5 biopsiat sõltumatutelt osalejatelt, võrreldes iga osaleja kiireid ja aeglaseid lihaskiude). Statistiline analüüs viidi läbi Limmi lineaarse mudeli meetodi ja empiirilise Bayesi lähenemisviisi kombinatsiooni abil, millele järgnes Benjamini-Hochbergi meetod mitmekordseks võrdluseks p-väärtuse korrigeerimisega. Kastidiagrammid näitavad mediaani, esimest ja kolmandat kvartiili, kus vurrud osutavad maksimaalsetele/minimaalsetele väärtustele.
Hiljutised uuringud on näidanud, et paljud oletatavad mittekodeerivad transkriptid kodeerivad transkribeeritud mikroobseid valke, millest mõned reguleerivad lihasfunktsiooni.44, 55 Potentsiaalselt kiutüübi spetsiifilisusega mikroobsete valkude tuvastamiseks otsisime oma 1000 kiu proteoomi andmekogumist kohandatud FASTA faili abil, mis sisaldas 1000 kiu transkriptoomi andmekogumist leitud mittekodeerivate transkriptide järjestusi (n = 305) (joonis 5D). Tuvastasime 22 erinevast transkriptist 197 mikroobset valku, millest 71 oli aeglaste ja kiirete skeletilihaskiudude vahel erinevalt reguleeritud (lisajoonis 9C ja lisaandmekogum 16). LINC01405 puhul tuvastati kolm mikroobse valgu produkti, millest üks näitas sarnast aeglase kiu spetsiifilisust oma transkriptiga (joonis 5E ja lisajoonis 9D). Seega tuvastasime LINC01405 geenina, mis kodeerib aeglaste skeletilihaskiudude suhtes spetsiifilist mikroobset valku.
Töötasime välja tervikliku töövoo üksikute lihaskiudude laiaulatuslikuks proteoomiliseks iseloomustamiseks ja tuvastasime tervete seisundite kiudude heterogeensuse regulaatorid. Rakendasime seda töövoogu, et mõista, kuidas nemaliinmüopaatiad mõjutavad skeletilihaskiudude heterogeensust. Nemaliinmüopaatiad on pärilikud lihashaigused, mis põhjustavad lihasnõrkust ja millega haigestunud lastel kaasnevad mitmesugused tüsistused, sealhulgas hingamisraskused, skolioos ja piiratud jäsemete liikuvus.19,20 Tavaliselt põhjustavad nemaliinmüopaatiate korral patogeensed variandid geenides, näiteks aktiin alfa 1 (ACTA1), aeglase tõmblemisega kiudude müokiudude koostise domineerimise, kuigi see mõju on heterogeenne. Üks märkimisväärne erand on troponiin T1 nemaliinmüopaatia (TNNT1), millel on kiirete kiudude domineerimine. Seega võib nemaliinmüopaatiate korral täheldatud skeletilihaskiudude düsregulatsiooni aluseks oleva heterogeensuse parem mõistmine aidata lahti harutada nende haiguste ja müokiudude tüübi vahelist keerulist seost.
Võrreldes tervete kontrollisikutega (n = 3 rühma kohta), näitasid nemaliinmüopaatiaga patsientidelt ACTA1 ja TNNT1 geenide mutatsioonidega eraldatud müokiudude märgatavat müokiudude atroofiat või düstroofiat (joonis 6A, lisatabel 3). See tekitas proteoomilise analüüsi jaoks olulisi tehnilisi väljakutseid olemasoleva materjali piiratud hulga tõttu. Sellest hoolimata suutsime tuvastada 272 skeleti müokiududes 2485 valku. Pärast vähemalt 1000 kvantifitseeritud valgu filtreerimist kiu kohta allutati 250 kiudu järgnevale bioinformaatilisele analüüsile. Pärast filtreerimist kvantifitseeriti keskmiselt 1573 ± 359 valku kiu kohta (lisajoonis 10A, lisaandmekogumid 17–18). Märkimisväärne on see, et vaatamata kiudude suuruse olulisele vähenemisele vähenes nemaliinmüopaatiaga patsientide proovide proteoomi sügavus vaid tagasihoidlikult. Lisaks võimaldas nende andmete töötlemine meie enda FASTA-failide (sh mittekodeerivate transkriptide) abil tuvastada nemaliinmüopaatiaga patsientide skeleti müokiududes viis mikroobset valku (lisaandmekogum 19). Proteoomi dünaamiline ulatus oli oluliselt laiem ja kontrollrühma valkude koguhulk korreleerus hästi varasema 1000-kiulise proteoomi analüüsi tulemustega (lisajoonis 10B–C).
A. Mikroskoopilised pildid, mis näitavad kiudude atroofiat või düstroofiat ja erinevate kiutüüpide domineerimist MYH põhjal ACTA1 ja TNNT1 nemaliinmüopaatiate (NM) korral. Skaalariba = 100 μm. Värvimise reprodutseeritavuse tagamiseks ACTA1 ja TNNT1 patsientidel värviti kolme patsiendi biopsiaid kaks kuni kolm korda (neli lõiku juhtumi kohta) enne representatiivsete piltide valimist. B. Kiutüüpide osakaal osalejatel MYH põhjal. C. Skeletilihaskiudude peamine komponentide analüüsi (PCA) graafik nemaliinmüopaatiatega patsientidel ja kontrollrühmal. D. Nemaliinmüopaatiatega patsientide ja kontrollrühma skeletilihaskiud projitseeritud PCA graafikule, mis on määratud joonisel 2 analüüsitud 1000 kiu põhjal. Näiteks vulkaanigraafikud, mis võrdlevad erinevusi ACTA1 ja TNNT1 nemaliinmüopaatiatega osalejate ja kontrollrühma vahel ning ACTA1 ja TNNT1 nemaliinmüopaatiatega osalejate vahel. Värvilised ringid tähistavad valke, mis erinesid oluliselt π < 0,05 juures, ja tumedad täpid tähistavad valke, mis erinesid oluliselt FDR < 0,05 juures. Statistiline analüüs viidi läbi Limma lineaarse mudeli meetodi ja empiiriliste Bayesi meetodite abil, millele järgnes p-väärtuse korrigeerimine mitmekordsete võrdluste jaoks Benjamini-Hochbergi meetodi abil. H. Oluliselt erinevalt ekspresseeritud valkude rikastamisanalüüs kogu proteoomi ulatuses ja 1. ja 2A tüüpi kiududes. Statistiline analüüs viidi läbi clusterProfiler paketi ja Benjamini-Hochbergi korrigeeritud p-väärtuste abil. I, J. Peakomponentide analüüsi (PCA) graafikud, mis on värvitud rakuvälise maatriksi ja mitokondriaalse geeni ontoloogia (GO) terminitega.
Kuna nemaliinmüopaatiad võivad mõjutada MYH-d ekspresseerivate müokiudude tüüpide osakaalu skeletilihastes,19,20 uurisime esmalt MYH-d ekspresseerivaid müokiudude tüüpe nemaliinmüopaatiatega patsientidel ja kontrollrühmas. Müokiudude tüübi määrasime erapooletu meetodi abil, mida on eelnevalt kirjeldatud 1000 müokiudude testi jaoks (täiendavad joonised 10D–E), ja meil ei õnnestunud taas tuvastada puhtaid 2X müokiududeid (joonis 6B). Täheldasime nemaliinmüopaatiate heterogeenset mõju müokiudude tüübile, kuna kahel ACTA1 mutatsiooniga patsiendil oli suurenenud 1. tüüpi müokiudude osakaal, samas kui kahel TNNT1 nemaliinmüopaatiaga patsiendil oli 1. tüüpi müokiudude osakaal vähenenud (joonis 6B). Tõepoolest, MYH2 ja kiirete troponiini isovormide (TNNC2, TNNI2 ja TNNT3) ekspressioon oli ACTA1-nemaliinmüopaatiate korral vähenenud, samas kui MYH7 ekspressioon oli TNNT1-nemaliinmüopaatiate korral vähenenud (lisajoonis 11A). See on kooskõlas varasemate aruannetega heterogeensest müokiudude tüübi vahetamisest nemaliinmüopaatiate korral.19,20 Kinnitasime neid tulemusi immunohistokeemia abil ja leidsime, et ACTA1-nemaliinmüopaatiaga patsientidel oli ülekaalus 1. tüüpi müokiududed, samas kui TNNT1-nemaliinmüopaatiaga patsientidel oli vastupidine muster (joonis 6A).
Ühekiulise proteoomi tasandil paiknesid ACTA1 ja TNNT1 nemaliinmüopaatiaga patsientide skeletilihaskiud enamiku kontrollkiududega koos, kusjuures TNNT1 nemaliinmüopaatiaga kiud olid üldiselt kõige tugevamalt mõjutatud (joonis 6C). See oli eriti ilmne iga patsiendi pseudo-paisutatud kiudude põhikomponentide analüüsi (PCA) graafikute joonistamisel, kusjuures TNNT1 nemaliinmüopaatiaga patsiendid 2 ja 3 näisid kontrollproovidest kõige kaugemal (lisajoonis 11B, lisaandmekogum 20). Müopaatiaga patsientide kiudude ja tervete kiudude võrdluse paremaks mõistmiseks kasutasime tervete täiskasvanud osalejate 1000 kiu proteoomilisest analüüsist saadud üksikasjalikku teavet. Projitseerisime müopaatia andmestikust (ACTA1 ja TNNT1 nemaliinmüopaatiaga patsiendid ja kontrollrühmad) pärinevad kiud 1000 kiu proteoomilisest analüüsist saadud PCA graafikule (joonis 6D). MYH kiudude tüüpide jaotus PC2 piki kontrollkiududes oli sarnane 1000 kiu proteoomilisest analüüsist saadud kiudude jaotusega. Enamik nemaliinmüopaatiaga patsientidel esinevatest kiududest nihkus aga PC2 suunas allapoole, kattudes tervete kiirete tõmblevate kiududega, olenemata nende natiivsest MYH-kiudude tüübist. Seega, kuigi ACTA1 nemaliinmüopaatiaga patsientidel täheldati MYH-põhiste meetodite abil kvantifitseerimisel nihkumist 1. tüüpi kiudude suunas, nihutasid nii ACTA1 nemaliinmüopaatia kui ka TNNT1 nemaliinmüopaatia skeletilihaskiudude proteoomi kiirete tõmblevate kiudude suunas.
Seejärel võrdlesime iga patsiendirühma otse tervete kontrollisikutega ja tuvastasime vastavalt 256 ja 552 erinevalt ekspresseeritud valku ACTA1 ja TNNT1 nemaliinmüopaatiate korral (joonis 6E–G ja lisajoonis 11C, lisaandmekogum 21). Geenirikastamise analüüs näitas mitokondriaalsete valkude koordineeritud vähenemist (joonis 6H–I, lisaandmekogum 22). Üllataval kombel oli see langus, hoolimata kiutüüpide erinevast domineerimisest ACTA1 ja TNNT1 nemaliinmüopaatiate korral, täiesti sõltumatu MYH-põhisest kiutüübist (joonis 6H ja lisajoonised 11D–I, lisaandmekogum 23). ACTA1 või TNNT1 nemaliinmüopaatiate korral olid reguleeritud ka kolm mikroobset valku. Kaks neist mikroproteiinidest, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (tuntud ka kui LINC00598 või Lnc-FOXO1) ja ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), näitasid erinevat küllust ainult 1. tüüpi müokiududes. Varem on teatatud, et ENSG00000215483_TR14_ORF67 mängib rolli rakutsükli regulatsioonis.56 Teisest küljest oli ENSG00000232046_TR1_ORF437 (vastab LINC01798-le) ACTA1-nemaliini müopaatia korral nii 1. kui ka 2A tüüpi müokiududes suurenenud võrreldes tervete kontrollisikutega (lisajoonis 12A, lisaandmekogum 24). Seevastu ribosomaalsed valgud ei mõjutanud nemaliini müopaatiat suuresti, kuigi RPS17 oli ACTA1 nemaliini müopaatias allareguleeritud (joonis 6E).
Rikastamisanalüüs näitas ka immuunsüsteemi protsesside ülesreguleerimist ACTA1 ja TNNT1 nemaliinmüopaatiate korral, samas kui TNNT1 nemaliinmüopaatia korral oli samuti suurenenud rakkude adhesioon (joonis 6H). Nende rakuväliste faktorite rikastumist peegeldasid rakuvälise maatriksi valgud, mis nihutasid PCA-d PC1 ja PC2-s negatiivses suunas (st enim kahjustatud kiudude suunas) (joonis 6J). Mõlemas patsiendirühmas täheldati immuunvastustes ja sarkolemma parandusmehhanismides osalevate rakuväliste valkude, näiteks anneksiinide (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 ja nendega interakteeruva valgu S100A1159 (lisajoonised 12B–C), suurenenud ekspressiooni. Varem on teatatud, et see protsess on lihasdüstroofiate korral tugevnenud60, kuid meie teada pole seda varem nemaliinmüopaatiatega seostatud. Selle molekulaarse mehhanismi normaalne toimimine on vajalik sarkolemma parandamiseks pärast vigastust ja äsja moodustunud müotsüütide sulandumiseks müokiududega58,61. Seega viitab selle protsessi suurenenud aktiivsus mõlemas patsiendirühmas müofibri ebastabiilsuse põhjustatud vigastusele reparatiivsele reageerimisele.
Mõlema nemaliinmüopaatia tüübi mõjud olid omavahel hästi korreleeritud (r = 0,736) ja näitasid mõistlikku kattumist (lisajoonised 11A–B), mis näitab, et ACTA1 ja TNNT1 nemaliinmüopaatial on proteoomile sarnane mõju. Siiski olid mõned valgud reguleeritud ainult ACTA1 või TNNT1 nemaliinmüopaatia korral (lisajoonised 11A ja C). Profibrootiline valk MFAP4 oli TNNT1 nemaliinmüopaatia korral üks enim ülesreguleeritud valke, kuid jäi ACTA1 nemaliinmüopaatia korral muutumatuks. SKIC8, mis on PAF1C kompleksi komponent, mis vastutab HOX geeni transkriptsiooni reguleerimise eest, oli TNNT1 nemaliinmüopaatia korral allareguleeritud, kuid ACTA1 nemaliinmüopaatia korral seda ei mõjutanud (lisajoonis 11A). ACTA1 ja TNNT1 nemaliinmüopaatia otsene võrdlus näitas TNNT1 nemaliinmüopaatia korral mitokondriaalsete valkude suuremat vähenemist ja immuunsüsteemi valkude suurenemist (joonis 6G–H ja lisajoonised 11C ja 11H–I). Need andmed on kooskõlas TNNT1 nemaliinmüopaatia korral täheldatud suurema atroofia/düstroofiaga võrreldes TNNT1 nemaliinmüopaatiaga (joonis 6A), mis viitab sellele, et TNNT1 nemaliinmüopaatia kujutab endast haiguse raskemat vormi.
Et hinnata, kas nemaliinmüopaatia täheldatud mõjud püsivad kogu lihase tasandil, viisime läbi sama TNNT1 nemaliinmüopaatia patsientide kohordi lihasbiopsiate massproteoomilise analüüsi ja võrdlesime neid kontrollrühmaga (n = 3 rühma kohta) (lisajoonis 13A, lisaandmekogum 25). Nagu oodatud, olid kontrollrühmad põhikomponentide analüüsis tihedalt seotud, samas kui TNNT1 nemaliinmüopaatia patsientidel ilmnes suurem valimitevaheline varieeruvus, mis sarnanes üksikkiudude analüüsis täheldatule (lisajoonis 13B). Massanalüüs reprodutseeris üksikute kiudude võrdlemisel esile tõstetud diferentseeritult ekspresseeritud valke (lisajoonis 13C, lisaandmekogum 26) ja bioloogilisi protsesse (lisajoonis 13D, lisaandmekogum 27), kuid kaotas võime eristada erinevaid kiutüüpe ja ei arvestanud kiudude heterogeenset haigusmõju.
Kokkuvõttes näitavad need andmed, et ühe müofiibri proteoomika abil saab selgitada kliinilisi bioloogilisi tunnuseid, mida ei ole võimalik tuvastada sihipäraste meetoditega, näiteks immunoblotanalüüsiga. Lisaks toovad need andmed esile aktiini kiudude tüpiseerimise (MYH) ainuüksi kasutamise piirangud fenotüübilise adaptatsiooni kirjeldamiseks. Tõepoolest, kuigi kiudude tüübi vahetamine erineb aktiini ja troponiini nemaliini müopaatiate puhul, lahutavad mõlemad nemaliini müopaatiad MYH kiudude tüpiseerimise skeletilihaskiudude metabolismist kiirema ja vähem oksüdatiivse lihasproteoomi suunas.
Rakkude heterogeensus on kriitilise tähtsusega kudede mitmekesiste vajaduste rahuldamiseks. Skeletilihastes kirjeldatakse seda sageli kiutüüpidena, mida iseloomustab erinev jõu tootmise ja väsimuse aste. Siiski on selge, et see selgitab vaid väikest osa skeletilihaskiudude varieeruvusest, mis on palju muutlikum, keerukam ja mitmetahulisem, kui varem arvati. Tehnoloogia areng on nüüd valgustanud skeletilihaskiude reguleerivaid tegureid. Tõepoolest, meie andmed viitavad sellele, et 2X tüüpi kiud ei pruugi olla eraldi skeletilihaskiudude alatüüp. Lisaks tuvastasime skeletilihaskiudude heterogeensuse peamisteks määrajateks metaboolsed valgud, ribosomaalsed valgud ja rakkudega seotud valgud. Rakendades oma proteoomilist töövoogu nematoodide müopaatiaga patsientide proovidele, näitasime veelgi, et MYH-põhine kiudude tüpiseerimine ei kajasta täielikult skeletilihaste heterogeensust, eriti kui süsteem on häiritud. Tõepoolest, olenemata MYH-põhisest kiutüübist, põhjustab nematoodide müopaatia nihkumist kiiremate ja vähem oksüdatiivsete kiudude suunas.
Skeletilihaskiude on klassifitseeritud alates 19. sajandist. Hiljutised oomika analüüsid on võimaldanud meil hakata mõistma erinevat tüüpi MYH kiude ekspressiooniprofiile ja nende reaktsioone erinevatele stiimulitele. Nagu siin kirjeldatud, on oomika lähenemisviisidel ka eeliseks suurem tundlikkus kiutüübi markerite kvantifitseerimisel võrreldes traditsiooniliste antikehadel põhinevate meetoditega, ilma et skeletilihaskiudude tüübi määratlemiseks tuleks tugineda ühe (või mõne) markeri kvantifitseerimisele. Kasutasime täiendavaid transkriptoomilisi ja proteoomilisi töövooge ning integreerisime tulemused, et uurida kiudude heterogeensuse transkriptsioonilist ja posttranskriptsioonilist regulatsiooni inimese skeletilihaskiududes. Selle töövoo tulemusel ei õnnestunud meie tervete noorte meeste kohordi vastus lateralis'es valgu tasemel tuvastada puhtaid 2X-tüüpi kiude. See on kooskõlas varasemate ühe kiu uuringutega, mis leidsid tervetes vastus lateralis'es <1% puhtaid 2X kiude, kuigi seda tuleks tulevikus kinnitada ka teistes lihastes. Erinevus peaaegu puhaste 2X kiudude tuvastamise vahel mRNA tasemel ja ainult segatud 2A/2X kiudude tuvastamise vahel valgu tasemel on hämmastav. MYH isovormi mRNA ekspressioon ei ole ööpäevane,67 mis viitab sellele, et me tõenäoliselt ei ole MYH2 algussignaali RNA tasandil pealtnäha puhastes 2X kiududes „ära märganud“. Üks võimalik seletus, ehkki puhtalt hüpoteetiline, võiks olla MYH isovormide valgu ja/või mRNA stabiilsuse erinevused. Tõepoolest, ükski kiire kiud ei ole ühegi MYH isovormi puhul 100% puhas ja on ebaselge, kas MYH1 mRNA ekspressioonitasemed vahemikus 70–90% annaksid valgu tasandil võrdse MYH1 ja MYH2 arvukuse. Kogu transkriptoomi või proteoomi arvesse võttes saab klasteranalüüs kindlalt tuvastada ainult kaks erinevat klastrit, mis esindavad aeglaseid ja kiireid skeletilihaskiude, olenemata nende täpsest MYH koostisest. See on kooskõlas analüüsidega, mis kasutavad ühetuumalisi transkriptoomilisi lähenemisviise, mis tavaliselt tuvastavad ainult kaks erinevat müonukleaarset klastrit.68, 69, 70 Lisaks, kuigi varasemad proteoomilised uuringud on tuvastanud 2X tüüpi kiude, ei moodustu need kiud eraldi klastritesse ülejäänud kiiretest kiududest ja näitavad vaid väikest arvu erinevalt külluslikke valke võrreldes teiste MYH-l põhinevate kiutüüpidega. 14 Need tulemused viitavad sellele, et peaksime naasma 20. sajandi alguse lihaskiudude klassifikatsiooni juurde, mis jagas inimese skeletilihaskiud mitte kolme eraldi klassi MYH põhjal, vaid kahte klastrisse nende metaboolsete ja kontraktiilsete omaduste põhjal. 63
Veelgi olulisem on see, et müokiudude heterogeensust tuleks vaadelda mitmes dimensioonis. Varasemad „oomika” uuringud on selles suunas osutanud, viidates sellele, et skeletilihaskiud ei moodusta eraldiseisvaid klastreid, vaid on paigutunud piki kontiinumit. 11, 13, 14, 64, 71 Siin näitame, et lisaks skeletilihaste kontraktiilsete ja metaboolsete omaduste erinevustele saab müokiudude eristada ka rakkudevaheliste interaktsioonide ja translatsioonimehhanismidega seotud tunnuste järgi. Tõepoolest, leidsime skeletilihaskiududes ribosoomi heterogeensust, mis aitab kaasa heterogeensusele sõltumatult aeglastest ja kiiretest kiudude tüüpidest. Selle olulise müokiudude heterogeensuse algpõhjus, mis ei sõltu aeglastest ja kiiretest kiudude tüübist, jääb ebaselgeks, kuid see võib viidata spetsiifilisele ruumilisele korraldusele lihaskiududes, mis reageerivad optimaalselt spetsiifilistele jõududele ja koormustele,72 spetsiifilisele rakulisele või organispetsiifilisele suhtlusele teiste rakutüüpidega lihaste mikrokeskkonnas73,74,75 või ribosoomi aktiivsuse erinevustele üksikute müokiudude sees. Tõepoolest, ribosomaalne heteroplasmia, kas RPL3 ja RPL3L paraloogse asendamise kaudu või rRNA 2'O-metüülimise tasemel, on osutunud seotuks skeletilihaste hüpertroofiaga . Multioomilised ja ruumilised rakendused koos üksikute müokiudude funktsionaalse iseloomustamisega edendavad veelgi meie arusaamist lihasbioloogiast multioomilisel tasandil .
Analüüsides nemaliinse müopaatiaga patsientidelt võetud üksikute müokiudude proteoome, näitasime ka üksikute müokiudude proteoomika kasulikkust, efektiivsust ja rakendatavust skeletilihaste kliinilise patofüsioloogia selgitamisel. Lisaks, võrreldes meie töövoogu globaalse proteoomilise analüüsiga, suutsime näidata, et üksikute müokiudude proteoomika annab sama sügavuse informatsiooni kui globaalne koeproteoomika ja laiendab seda sügavust, arvestades kiududevahelist heterogeensust ja müokiudude tüüpi. Lisaks oodatavatele (ehkki muutuvatele) erinevustele kiudude tüüpide suhtes, mida täheldati ACTA1 ja TNNT1 nemaliinse müopaatiaga patsientidel võrreldes tervete kontrollisikutega,19 täheldasime ka oksüdatiivset ja rakuvälist remodelleerumist, mis ei olnud MYH-vahendatud kiudude tüübi vahetamisest sõltumatu. Fibroosi on varem täheldatud TNNT1 nemaliinmüopaatiate korral.19 Meie analüüs tugineb aga sellele leiule, paljastades ka ACTA1 ja TNNT1 nemaliinmüopaatiatega patsientide müokiududes suurenenud rakuväliste sekreteeritavate stressiga seotud valkude, näiteks anneksiinide, mis osalevad sarkolemma parandusmehhanismides.57,58,59 Kokkuvõtteks võib öelda, et nemaliinmüopaatiaga patsientide müokiudude suurenenud anneksiinide tase võib viidata rakulisele vastusele raskelt atroofiliste müokiudude parandamiseks.
Kuigi see uuring kujutab endast seni suurimat inimeste üksikkiudude terviklihase-oomika analüüsi, pole sellel ka piiranguid. Me eraldasime skeletilihaskiud suhteliselt väikesest ja homogeensest osalejate valimist ning ühest lihasest (vastus lateralis). Seetõttu on võimatu välistada spetsiifiliste kiudude populatsioonide olemasolu eri lihastüüpide ja lihasfüsioloogia äärmuste korral. Näiteks ei saa me välistada võimalust, et ülikiirete kiudude alamhulk (nt puhtad 2X kiud) ilmneb kõrgelt treenitud sprinteritel ja/või jõusportlastel79 või lihaste passiivsuse perioodidel66,80. Lisaks takistas osalejate piiratud valimi suurus meil uurimast soolisi erinevusi kiudude heterogeensuses, kuna teadaolevalt erinevad kiudude tüüpide suhted meeste ja naiste vahel. Lisaks ei saanud me läbi viia transkriptoomilisi ja proteoomilisi analüüse samadel lihaskiududel ega samadelt osalejatelt võetud proovidel. Kuna meie ja teised jätkame üherakuliste ja ühe müofiibri analüüside optimeerimist omika analüüsi abil, et saavutada ülimadal proovi sisend (nagu siin on näidatud mitokondriaalse müopaatiaga patsientide kiudude analüüsis), ilmneb võimalus kombineerida multiomika (ja funktsionaalseid) lähenemisviise üksikute lihaskiudude piires.
Üldiselt tuvastavad ja selgitavad meie andmed skeletilihaste heterogeensuse transkriptsioonilisi ja posttranskriptsioonilisi tegureid. Täpsemalt esitame andmeid, mis seavad kahtluse alla skeletilihaste füsioloogias pikaajalise dogma, mis on seotud klassikalise MYH-põhise kiutüüpide definitsiooniga. Loodame uuendada arutelu ja lõppkokkuvõttes ümber hinnata oma arusaama skeletilihaste kiudude klassifikatsioonist ja heterogeensusest.
Neliteist valgenahalist osalejat (12 meest ja 2 naist) nõustusid vabatahtlikult selles uuringus osalema. Uuringu kiitis heaks Genti Ülikooli Haigla eetikakomitee (BC-10237), see vastas 2013. aasta Helsingi deklaratsioonile ja registreeriti aadressil ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Osalejate üldiseloomustus on esitatud lisatabelis 1. Pärast suulise ja kirjaliku nõusoleku saamist läbisid osalejad enne uuringusse kaasamist tervisekontrolli. Osalejad olid noored (22–42-aastased), terved (ilma terviseprobleemideta, suitsetamisajaloota) ja mõõdukalt füüsiliselt aktiivsed. Maksimaalset hapnikutarbimist määrati füüsilise vormisoleku hindamiseks mõeldud astmeergomeetri abil, nagu eelnevalt kirjeldatud.81
Lihasbiopsiaproovid koguti puhkeolekus ja tühja kõhuga kolm korda 14-päevase intervalliga. Kuna need proovid koguti suurema uuringu osana, tarbisid osalejad 40 minutit enne biopsiat platseebot (laktoos), H1-retseptori antagonisti (540 mg feksofenadiini) või H2-retseptori antagonisti (40 mg famotidiini). Oleme varem näidanud, et need histamiini retseptori antagonistid ei mõjuta puhkeolekus skeletilihaste vormi81 ja meie kvaliteedikontrolli graafikutel ei täheldatud seisundiga seotud klasterdumist (lisajoonised 3 ja 6). Standardiseeritud dieeti (41,4 kcal/kg kehakaalu kohta, 5,1 g/kg kehakaalu kohta süsivesikuid, 1,4 g/kg kehakaalu kohta valku ja 1,6 g/kg kehakaalu kohta rasva) hoiti 48 tundi enne iga katsepäeva ning standardiseeritud hommikusööki (1,5 g/kg kehakaalu kohta süsivesikuid) tarbiti katsepäeva hommikul. Kohaliku tuimestuse all (0,5 ml 1% lidokaini ilma epinefriinita) võeti lihasbiopsiad vastus lateralis lihasest perkutaanse Bergströmi aspiratsiooni abil.82 Lihasproovid sisestati kohe RNAlaterisse ja säilitati temperatuuril 4 °C kuni käsitsi kiudude dissektsioonini (kuni 3 päeva).
Värskelt isoleeritud müokiudude kimbud viidi kultuurinõus olevasse värskesse RNAlater söötmesse. Seejärel dissekteeriti üksikud müokiudude kiud käsitsi stereomikroskoobi ja peente pintsettide abil. Igast biopsiast eraldati 25 kiudu, pöörates erilist tähelepanu kiudude valimisele biopsia erinevatest piirkondadest. Pärast dissekteerimist kasteti iga kiud õrnalt 3 μl lüüsipuhvrisse (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad), mis sisaldas proteinaas K ja DNaasi ensüüme, et eemaldada soovimatud valgud ja DNA. Seejärel käivitati rakkude lüüs ja valkude/DNA eemaldamine lühikese keeristusega, vedeliku tsentrifuugis tsentrifuugides tsentrifuugides ja inkubeerimisega toatemperatuuril (10 minutit). Seejärel inkubeeriti lüsaati termotsükleris (T100, Bio-Rad) temperatuuril 37 °C 5 minutit, temperatuuril 75 °C 5 minutit ja seejärel hoiti kohe temperatuuril -80 °C kuni edasise töötlemiseni.
Illumina-ühilduvad polüadenüleeritud RNA teegid valmistati 2 µl müofiibri lüsaadist, kasutades QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq teegi ettevalmistuskomplekti (Lexogen). Üksikasjalikud meetodid leiate tootja käsiraamatust. Protsess algab esimese ahela cDNA sünteesiga pöördtranskriptsiooni teel, mille käigus sisestatakse unikaalsed molekulaarsed identifikaatorid (UMI-d) ja proovispetsiifilised i1 vöötkoodid, et tagada proovide ühendamine ja vähendada tehnilist varieeruvust järgneva töötlemise ajal. Seejärel ühendatakse 96 müofiibri cDNA ja puhastatakse magnethelmestega, mille järel RNA eemaldatakse ja teise ahela süntees viiakse läbi juhuslike praimerite abil. Teek puhastatakse magnethelmestega, lisatakse kollektsioonispetsiifilised i5/i7 märgised ja amplifitseeritakse PCR-iga. Viimases puhastamisetapis saadakse Illumina-ühilduvad teegid. Iga teegikogumi kvaliteeti hinnati kõrge tundlikkusega väikeste fragmentide DNA analüüsi komplekti (Agilent Technologies, DNF-477-0500) abil.
Qubiti kvantifitseerimise põhjal ühendati ühendid edasi ekvimolaarsetes kontsentratsioonides (2 nM). Saadud ühendit sekveneeriti seejärel NovaSeq 6000 instrumendil standardrežiimis, kasutades NovaSeq S2 reagendikomplekti (1 × 100 nukleotiidi) ja 2 nM kontsentratsiooni (4% PhiX).
Meie andmevoog põhineb Lexogeni QuantSeq Pooli andmeanalüüsi torujuhtmel (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Andmed demultipleksiti esmalt bcl2fastq2-ga (v2.20.0) i7/i5 indeksi põhjal. Seejärel demultipleksiti lugem 2 idemuxiga (v0.1.6) i1 proovi vöötkoodi põhjal ja UMI järjestused ekstraheeriti umi_toolsiga (v1.0.1). Seejärel kärbiti lugemeid cutadapt (v3.4) abil mitmes voorus, et eemaldada lühikesed lugemised (<20 pikkused) või lugemised, mis koosnesid ainult adapterjärjestustest. Seejärel joondati lugemid inimese genoomiga, kasutades STAR-i (v2.6.0c), ja BAM-failid indekseeriti SAMtoolsiga (v1.11). Topeltlugemised eemaldati umi_toolsiga (v1.0.1). Lõpuks teostati joondamise loendamine, kasutades Subreadi (v2.0.3) funktsiooni featureCounts. Kvaliteedikontrolli teostati FastQC (v0.11.9) abil torujuhtme mitmes vaheetapis.
Kogu edasine bioinformaatika töötlemine ja visualiseerimine viidi läbi R-is (v4.2.3), kasutades peamiselt Seurati (v4.4.0) töövoogu.83 Seetõttu teisendati individuaalsed UMI väärtused ja metaandmete maatriksid Seurati objektideks. Geenid, mida ekspresseeriti vähem kui 30% kõigist kiududest, eemaldati. Madala kvaliteediga proovid eemaldati minimaalse lävendi, mis oli 1000 UMI väärtust ja 1000 tuvastatud geeni, alusel. Lõpuks läbis kõik kvaliteedikontrolli filtreerimisetapid 925 kiudu. UMI väärtused normaliseeriti Seurati SCTransformi v2 meetodi abil,84 hõlmates kõiki 7418 tuvastatud tunnust, ja osalejate vahelised erinevused regressioonianalüüsi abil välja arvutati. Kõik asjakohased metaandmed leiate lisaandmestikust 28.
Postituse aeg: 10. september 2025